ICS 65.020.01 CCS B 05 黑 龙 DB23 江 省 地 方 标 准 DB23/T 3234—2022 野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌资源 调查技术规程 2022-05-25 发布 黑龙江省市场监督管理局 2022-06-24 实施 发 布 DB23/T 3234—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省林业和草原局提出。 本文件起草单位：黑龙江省林业科学研究所、东北林业大学、黑龙江省克东县森林病虫害防治检疫 站、黑龙江省林业和草原局调查规划设计院、黑龙江省庆安国有林场管理局苗圃、黑龙江省海伦市双河 林场。 本文件主要起草人：李丽丽、杨洪一、李向东、孙国芝、关大伟、崔崧、周志军、刘忠玲、李佳一、 郜宪宇。 I DB23/T 3234-2022 野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌资源调查技术规程 1 范围 本文件规定了野生越桔(Vaccinium vitis-idaea L.)根际土壤可培养细菌、真菌资源调查的野外调查、 微生物分离纯化、微生物鉴定及结果、调查结果和调查档案。 本文件适用于野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌的资源调查。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 1736—2009 微生物肥料菌种鉴定技术规范 3 术语与定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 野外调查 4.1 工具与器材 定位仪、采集刀（铲）、冰盒、纸袋、塑封袋、记录本、记录笔、标签、数码相机、测绳（100 m）、 手摇皮尺（100 m）、钢卷尺（5 m）、枝剪、捆绳、天平、铁锹、土壤环刀、土壤铝盒等。 4.2 调查对象 通过查阅资料、实际踏查，了解调查地区野生越桔分布状况、生态类型及其伴生植被种类，选定调 查区域及不同群落的野生越桔作为调查对象。 4.3 调查内容 野生越桔的生物学特性及生境信息（见附录 A）、根际土壤样品采集。 4.4 调查方法 4.4.1 野生越桔的生态学特性及生境调查 采用样方调查法。选择代表性植物群落，在结果期进行调查采样。随机设置 3 个 5 m×5 m 的样方， 各样方间距离大于 10 m。记录样方的经纬度、海拔高度及伴生植被种类等，拍摄生境数码照片。每个 样方随机选取 5 株生长良好的越桔，分别测量其植株高度、基径等指标，作为样方的基础数据。 剪去地上植物，利用直径 5 cm 的土钻分 0 cm～10 cm、11 cm～20 cm、21 cm～30 cm 三层收集土 壤样品，五点取样并混合，室内风干，过 2 mm 筛后保存。 1 DB23/T 3234-2022 4.4.2 根际土壤样品采集 采用五点采样法。选取样方内正常生长的越桔植株，去除地上腐殖质及表层土壤，顺着植株主根进 行挖掘，采集 5 cm～30 cm 土层的越桔根部，轻轻去掉根系表面附着物及大块土壤，不应伤到根系，轻 轻抖落根部附着土壤，未抖落的留存土为根际土，用无菌毛刷收集根际土。收集时带一次性橡胶手套。 五份根际土壤混合放入无菌封口袋中，附上标签，记录采样信息。将取得土样立即放入冰盒保存，带回 实验室 4℃冰箱保存。 5 微生物分离纯化 5.1 越桔根际土壤可培养细菌分离与纯化 5.1.1 细菌分离与纯化培养基 根际土壤可培养细菌分离与纯化培养采用营养肉汤培养基，按附录 B 中 B.1 规定执行。固氮菌分 离与纯化培养采用 Ashby 无氮培养基，按附录 B 中 B.2 规定执行。放线菌分离与纯化培养采用高氏一 号培养基，按附录 B 中 B.3 规定执行。 5.1.2 细菌分离与纯化方法 采用稀释平板涂布法分离、纯化。取 1 g 根际土壤（干重），按附录 C 规定执行，置于内含玻璃珠 和 99 mL 无菌水的锥形瓶中，180 rpm 震荡 30 min，制成土壤悬浊液。取土壤悬浊液 1 mL，采用连续 稀释法配成浓度为 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 的土壤悬浊液。取浓度梯度为 10-4、10-5、10-6 的土 壤悬浊液，每一浓度吸取 100 μL，涂布于固体培养基，每一浓度重复涂布 3 次。细菌在 37℃培养 48 h。 观察菌落的大小、形状、质地、边缘、隆起、颜色、光泽、透明度。放线菌在 28℃培养 5 d～10 d，观 察菌落的大小、形状、气生菌丝及基内菌丝的颜色。将不同形态的菌落在新的平板上反复纯化培养，直 至平板上菌落表面形态特征相同并出现单菌落。挑取细菌培养物进行简单染色或革兰氏染色，显微镜下 观察菌体形态。菌落和菌体形态一致者，标志着培养物符合要求。 5.2 根际土壤可培养真菌分离与纯化 5.2.1 真菌分离与纯化培养基 根际土壤可培养丝状真菌分离与纯化培养采用 PDA 培养基，按附录 B 中 B.4 规定执行。酵母菌分 离与纯化培养采用麦芽汁琼脂培养基，按附录 B 中 B.5 规定执行。 5.2.2 真菌分离与纯化方法 采用稀释平板涂布法分离、纯化。取植物根际土壤 1 g（干重），按附录 C 规定执行，移入装有 9 mL 无菌水的试管中进行梯度稀释，稀释度分别为 10-1~10-3，各取 100 μL 涂布于固体培养基上，每一浓度 重复涂布 3 次。丝状真菌在 25℃～28℃培养 2 d～14 d，观察菌落质地、颜色、生长速度、色素的产生 情况、渗出液、菌落背面的颜色。酵母菌在 25℃～28℃培养 3 d～7 d，观察菌落的大小、形状、质地、 隆起、边缘、颜色、光泽。将不同形态的菌落在新的平板上进行培养纯化，直至平板上菌落表面形态特 征相同并出现单菌落。酵母菌和丝状真菌制成水浸片，显微镜下观察菌体形态。菌落和菌体形态一致者， 标志着培养物符合要求。 6 微生物鉴定及结果 野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌的鉴定方法及结果按 NY/T 1736—2009 中 6 和 7 的规定执行。 2 DB23/T 3234-2022 7 调查结果 7.1 种类组成 对获得的野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌种类进行整理、归类，填写微生物物种名录表（见附 录 D），了解野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌种类组成，分析其物种多样性。 7.2 分布特点 分析不同生境下野生越桔根际土壤可培养细菌、真菌的种类差异，了解各种野生越桔根际土壤可培 养细菌、真菌的分布特点及其与特定植被或生境的关系。 8 调查档案 应建立调查档案，内容包括：野外调查、调查对象、调查内容、调查方法、微生物分离纯化、微 生物鉴定及结果、调查结果、微生物种类组成、微生物分布特点。 3 DB23/T 3234-2022 附 录 A (资料性) 样地调查取样记录表 A.1 样地调查取样记录表见表 A.1。 表 A.1 样地调查取样记录表 样地号： 调查员： 序号 调查内容 调查指标 1 调查地点 地理位置 2 调查时间 物候期 调查因子描述 （1）省 （2）县（市、区） （4）村（工区） （5）林班 （1） 年 月 （3）乡（林场） （6）小班 日 （2）物候观测 林型 坡向 3 地形因子 坡度 坡位 （1）山脊 （2）上腹 （3）中腹（4）下腹 （5）山谷 （6）平地 海拔 （1） m （2）地理坐标 土壤类型 腐殖质层厚度（cm） 土壤质地 土壤 pH 值 4 土壤因子 土壤含水率（%） 土壤养分 （1）土壤的全氮含量(g/100g) （2）土壤的全磷含量(g/100g) （3）土壤的全钾含量(g/100g) （4）土壤的碱解氮含量(g/100g) （5）土壤的速效磷含量(g/100g)（6）土壤的速效钾含量(g/100g) （7）土壤的有机质含量(g/kg-1) 5 植被因子 植物种类 主要植物种类（建群种、优势种）及多度、盖度。 （1）日照时数(h) 6 气象因子 因子类型 （2）年均温度(℃) （3）最高温度(℃) （4）最低温度(℃) （5）积温(℃) （6）降水量(mm) （7）无霜期(d) 7 越桔生物学 特性 特性类型 （1）平均株高(cm) （2）密度(株/m2) （3）丛幅(cm2) （4）根深(cm) （5）产果量(个/株) （6）果重(g/株) （7）平均单果重(g) （8）基径(cm) 1 DB23/T 3234-2022 AA 附 录 B (规范性) 菌种培养和形态特征观察常用培养基配方 B.1 营养肉汤培养基 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠(NaCl) 琼脂 蒸馏水 pH B.2 3.0 g 10.0 g 5.0 g 15~20 g 1000 mL 7.2~7.4 Ashby 无氮培养基 甘露醇 磷酸二氢钾(KH2PO4) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 氯化钠(NaCl) 硫酸钙(CaSO4·2H2O) 碳酸钙(CaCO3) 琼脂 蒸馏水 pH 10.0 g 0.2 g 0.2 g 0.2 g 0.1 g 5.0 g 15~20 g 1000 mL 7.0 B.3 高氏一号培养基 硝酸钾(KNO3) 磷酸氢二钾(K2HPO4·3H2O) 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 氯化钠(NaCl) 硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 可溶性淀粉[(C6H10O5)n] 琼脂 蒸馏水 pH 1.0 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.01 g 20.0 g 18.0 g 1000 mL 7.2~7.4 B.4 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 马铃薯 200 g 葡萄糖(C6H12O6) 20.0 g 琼脂 18.0 g 蒸馏水 1000 mL pH 6.0~6.5 称取去皮马铃薯 200 g，切块，放入水中煮沸 30 min，用双层纱布过滤取汁，补足水至 1000 mL。 B.5 麦芽汁琼脂培养基 麦芽提取物 琼脂 蒸馏水 pH 2 20.0 g 18.0 g 1000 mL 5.4~6.0 DB23/T 3234-2022 附 录 C (规范性) 根际土样湿重的计算 C.1 根际土样湿重的计算按如下公式进行。 应用越桔根际土样分离微生物时，根际土样湿重计算按公式（1）进行。 m 湿 =（θ+1）× m 干 …………………………（1） 式中: θ —— 土壤含水率（%）； m 干 —— 干土重量（g）； m 湿 —— 湿土重量（g）。 3 DB23/T 3234