ICS 65.020.01 B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 36829—2018 甘蔗宿根矮化病菌 实时荧光PCR检测方法 Detection of Leifsonia xyli subsp. xyli by real-time PCR 2019-04-01实施 2018-09-17发布 国家市场监督管理总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 36829—2018 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 中心、农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室。 本标准主要起草人：高三基、孙生仁、王恒波、傅华英、黄美婷、王锦达、张慧丽、陈如凯。 GB/T36829—2018 引言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到与甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量 PCR相关的专利的利用。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场 该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下 联系方式获得： 专利持有人姓名：王恒波。 地址：福建省福州市仓山区上下店路15号。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专 利的责任。 GB/T36829—2018 甘蔗宿根矮化病菌 实时荧光PCR检测方法 1范围 本标准规定了甘蔗宿根矮化病菌（Leifsoniaylisubsp.ryli）实时荧光PCR检测方法的仪器与 设备、试剂与材料、样品的采集与前处理、检测以及结果判断与表述等。 本标准适用于可能带有甘蔗宿根矮化病菌的活体寄主植物的快速检测、诊断。 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（CetyltrimethylAmmoniumBromide） Ct值：循环阈值（CycleThreshold) DNase：脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease) FAM:6-羧基荧光素（6-Carboxy-Fluorescein） Lxx：甘蔗宿根矮化病菌（Leifsoniarylisubsp.ayli) Part-l：甘蔗宿根矮化病菌基因组上编码的一种致病性基因（PathogenicityGene-1) PCR：聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction) RNase：核糖核酸酶（Ribonuclease） TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明（6-Carboxytetramethylrhodamine） 3 甘蔗宿根矮化病菌基本信息 甘蔗宿根矮化病菌属于微杆菌科Microbacteriaceae雷弗松氏细菌属Leifsonia成员，拉丁文学名 名称为Leifsoniaaylisubsp.ayli，缩写为Lxx。甘蔗宿根矮化病菌其他信息参见附录A。 4方法原理 根据宿根矮化病菌的致病基因Pat-1序列设计一对仅在该病菌Pat-1基因间保守的特异性引物和 一条特异性的荧光双标记TaqMan探针。在实时荧光PCR扩增反应中，TaqMan探针的荧光信号强度 伴随着目标序列PCR扩增产物的增加呈正比关系，通过收集PCR扩增过程的荧光信号值，即可判断试 样是否带有目标序列。 仪器与设备 TaqMan探针；升降温速度≥2.0℃/s；均一性士0.5℃；准确性士0.3℃；温度范围4℃～100℃。 5.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 5.3电子天平：感量0.01g。 1 GB/T36829—2018 5.4高速台式冷冻离心机：离心力12000g以上。 5.5微量加样器：0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，2μL~20μL,10μL~100μL,20μL~200μL， 50 μL~1 000 μL。 5.6离心管：1.5mL、2.0mL。 5.7PCR反应管、带滤芯Tip头、实时荧光PCR反应管。 5.8恒温水浴锅。 5.9鼓风干燥箱。 5.10冰箱：2℃~4℃、-20℃、-80℃。 5.11 生物安全柜。 5.12 采样工具：砍刀、剪刀、镊子、带槽钻子。 6 试剂与材料 6.1试剂 除非另有规定外，在分析中仅使用分析纯试剂，实验用水符合GB/T6682的二级水指标，其中涉及 PCR的用水要求达到一级水指标。 6.1.1无水乙醇。 6.1.2异丙醇。 6.1.3β-巯基乙醇。 6.1.4 RNase酶(10 mg/mL)。 6.1.5三氯甲烷-异戊醇（24：1)。 6.1.6苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25：24：1）。 6.1.7荧光PCR反应混合液 包括2X荧光PCR反应液（含TaqDNA聚合酶）、5'-引物、3'-引物、TaqMan探针等，具体配制方 法见附录B。 6.1.82XCTAB抽提缓冲液：100mmol/LTris-HCl(pH8.0),20mmol/LEDTA-Na2,1.4mol/L氯 化钠，2%CTAB，使用前加入0.1%（体积分数）的β-巯基乙醇 6.1.93mol/L醋酸钠(NaAc,pH5.2)。 6.1.10 70%乙醇。 6.1.11无菌水。 6.1.12检测引物： 5'-引物:5'-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3'。 3'-引物:5'-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3”。 扩增片段大小：106bp。 6.1.13TaqMan 探针:5'-FAM-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-TAMRA-3'。 6.2 2材料 6.2.1阳性对照：用已知含甘蔗宿根矮化病菌的甘蔗样品作阳性对照。 6.2.2 阴性对照：用已知不含甘蔗宿根矮化病菌的甘蔗样品作阴性对照。 6.2.3 空白对照：用无菌一级水代替样品。 2