ICS 65.020.30 CCS B 41 团 体 标 准 T/CVMA 126-2023 规模化养殖场奶牛乳房炎常见致病菌检测 技术 Detection technology of common pathogenic bacteria of dairy cow mastitis in large-scale farms 2023 - 7 - 14发布 2023 - 7 - 14实施 中国兽医协会 发 布 N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA126—2023 I前  言 本文件按照 GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由青岛市动物疫病预防控制中心提出。 本文件由中国兽医协会归口。 本文件的起草单位 ：青岛市动物疫病预防控制中心 、青岛博霖生物科技有限公司 、中国动物卫生与 流行病学中心 、青岛农业大学 、济南深蓝动物保健品有限公司 、山东省农业科学院畜牧兽医研究所 、平 度市动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：李彦、赵永达、段笑笑、曲志娜、郭莉莉、刘蒙达、杨胜男、马帅、王洪波 、 杨宏军、张严琦、邴啟政、尹斐斐、江强世、刘枢清、王志文、栾正庆、田丽华、方杰、盛健、王琳、 张亮。 N-VýQ}S;SOO CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA126—2023 1规模化养殖场奶牛乳房炎常见致病菌检测技术 1范围 本文件确定了规模化养殖场 奶牛乳房炎 的样品采集、登记、实验室检测和记录的程序 。 本文件适用于奶牛疑似乳房炎的确诊。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期的引用文件 ， 仅该日期对应的版本适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所有的修改单 ）适用于本 文件。 NY/T2692奶牛隐性乳房炎快速诊断技术 NY/T2962奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、 凝固酶阴性葡萄球菌 、无乳链球菌分离鉴定方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 奶牛乳房炎 bovine mastitis 多由机械性刺激、病原菌浸入及化学物理性损伤所致的乳房实质、间质的炎症。 。 3.2 临床型乳房炎 clinical mastitis 乳房和乳汁有肉眼可见临床变化的炎症。 3.3 隐性乳房炎 subclinic mastitis 即亚临床型乳房炎 ，肉眼观察奶牛没有炎症征候 ，但是乳汁检查呈现炎性变化 （含有微生物 、细胞 数增加、乳汁化学特性发生变化）的一种乳房炎表现类型。 3.4 泌乳期 lactation period 奶牛从分娩后开始泌乳之日起到停止泌乳（人工停乳或自然停乳）之间的一段时间。 3.5 干乳期 dryperiod 经产奶牛 从停止泌乳之日起到分娩后重新泌乳之间的一段时期。 N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA126—2023 23.6 病原菌 pathogenic bacteria 可以侵犯机体，引起感染甚至传染病的微生物 。 注：或称病原体。病原体中， 以细菌和病毒的危害性最大。感染奶牛乳房炎的常见病原菌包括传染性病原菌、 环境 性病原菌。 4临床诊断 4.1临床型乳房炎 临床型乳房炎发病率较低 ，可根据临床表现 “红、肿、热、痛”的典型症状进行判定 。具体表现为 ： 患病乳房肿胀 、坚硬、发热、发红；乳汁减少或消失 ；乳汁稀薄 ，含有絮状物 、凝块或脓汁 。热痛消失 后，常见乳房 体积缩小变硬 ，乳头基部常形成结节 ，仅能挤出少量乳汁或完全停奶 。病牛有时出现精神 沉郁、食欲减退、体温升高等全身症状，患侧后肢步态异常。 4.2无临床症状的 乳房炎 又称亚临床型乳房炎 ，是一种无临床症状表现的乳房炎 。其特征是乳房和乳汁无肉眼可见异常 ，而 乳汁在理化性质，如乳汁中的酶、体细胞数、 pH等发生变化，且能分离到可致病的病原菌。 5致病菌的分离 5.1样品采集 5.1.1外观观察 对疑似患病奶牛采样前， 应对奶牛的整体状况，包括精神状态、乳房外观、乳汁性状等进行观察 。 5.1.2试剂与材料 参考附录 A中的规定，结合 CLSI中规定的进行。 5.1.3乳房清洁 乳头周围无污物，用专用消毒毛巾或一次性纸巾擦除乳头表面的灰尘和污物。若整个乳房较脏时 ， 用小水流或消毒毛巾沾水清洗乳头基部即可 。不宜用水对全部乳房冲洗 。清洁乳头后马上擦干 。必要情 况下，采用 0.2%新洁尔灭浸泡的脱脂棉或 75%酒精进行消毒。 5.1.4乳头清洁 清洗乳头分为淋洗、擦干、按摩。淋洗后用干净毛巾或纸巾擦净。 5.1.5采样和保存 对于疑似乳房炎奶牛 ，分别取左前 、左后、右前、右后4个乳区进行取样 。采集样品前 ，用碘酊沾 洗每一个乳头端， 应弃掉前 3把奶，再手工挤奶或采用无菌采样器从疑似患病乳区采集 5mL以上乳汁 于无菌采集管中。 采集的乳汁样品应 在2°C～8°C条件下冷藏 ，尽快送检，也可置 2°C～8°C低温保存待检。 N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA126—2023 35.1.6样品记录 包括样品种类、奶牛场名称、地址、牛编号、乳室、采样日期、送检日期、收样人等详细信息。 6实验室诊断 6.1细菌的分离培养 按照NY/T2692、NY/T2962、CLSI[1]的规定进行操作 。常见病原菌的培养 参考附录A的规定进行 。 6.2细菌的鉴定 采用革兰氏染色法 ，对分离到的单菌落进行染色观察 ，初步判断细菌类型 。按照《伯杰细菌鉴定手 册》[2]进行生化鉴定 ，或使用全自动微生物鉴定系统； 采用奶牛乳房炎细菌 16联荧光定量 PCR检测试 剂盒检测；或采用 16S核糖体 RNA（16SrRNA ）基因测序技术 。 6.3乳汁体细胞 检测 按照NY/T2692规定进行判定，也可采用商品化的隐性乳房炎诊断试剂进行检验判定，乳汁中的 体细胞数量异常升高 。或按加州乳房炎检测法 （California Mastitis Test，CMT），将采集的疑似患病奶 牛的乳汁，在表面活性物质和碱性药物作用下，使乳中体细胞被破坏，释放出 DNA，按CMT操作说 明及判定标准，进行奶牛隐 性乳房炎的判定。 一般以每毫升牛奶中含 20万个细胞为亚临床乳房炎的临界值（＋）；超过该值为阳性，低于该值 则正常。 如采用 CMT法，可按表 1进行判定。 表1CMT法的判定方法及标准 反应判定 被检乳 反应状态体细胞数 （千/毫升） － 阴性混合物呈液体状 ，倾斜检验盘时 ，流动流畅 ，无凝块 0～200 ± 可疑混合物呈液体状，盘底有微量沉淀物，摇动时消失 200～500 ＋ 弱阳性盘底出现少量黏性沉淀物 ，非全部形成凝胶状 ，摇动 时，沉淀物散布于盘底，有一定的黏性500～800 ＋＋ 阳性全部呈凝胶状 ，有一定黏性 ，回转时向心集中 ，不易 散开800～5000 ＋＋＋ 强阳性混合物大部分或全部形成明显的胶状沉淀物，黏稠 ， 几乎完全黏附与盘底，旋转摇动时，沉淀集于中心 ， 难以散开＞5000 7档案与记录 N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA126—2023 4对每头奶牛建立个体档案 ，及时记录每头奶牛的检测日期 、农场主姓名 、品种、年龄、胎次、产奶 量、感染病原菌种类，其他需要记录的写在备注。具体内容见附录 B。 N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA126—2023 5附录A （资料性） 常见病原菌的培养基及培养条件 表A.1给出了常见病原菌的培养基及培养条件。 表A.1常见病原菌的培养基及培养条件 病原菌 培养基 培养条件 金黄色葡萄球菌 营养琼脂培养基 需氧或兼性厌氧，最适生长温度 37°C，最适 生长pH7.4 无乳链球菌 血琼脂培养基 35℃培养18h～24h 停乳链球菌 血琼脂培养基 35℃培养18h～24h 牛支原体 PPLO固体培养基 （含20%马血清），培养基 pH 7.9最佳CO2条件培养 5d～7d 乳房链球菌 血琼脂培养基 55℃培养1d～2d 凝固酶阴性葡萄球菌 血琼脂培养基 35℃培养18h～24h，部分延长至 48h～72h 肠球菌 血琼脂培养基 37℃培养18h 大肠埃希氏菌 营养琼脂培养基 37℃培养6h～8h 肺炎克雷伯氏菌 营养琼脂培养基 37℃培养12h～18h 产气肠杆菌 血琼脂培养基 35℃培养18h～24h 沙雷氏菌 普通琼脂培养基 25℃～30℃培养1d～2d 变形杆菌 普通琼脂培养基 在20℃～40℃之间繁殖旺盛 志贺氏菌 普通琼脂培养基 37℃培养12h～18h 沙门氏菌 普通琼脂培养基 37℃培养12h～18h 绿脓杆菌 普通琼脂培养基 培养最适生长温度为 35℃，pH为7.2，CO2 5%～10%有助于生长 化脓放线菌 血琼脂培养基 最适生长温度 37℃，20℃～40℃生长 牛棒状杆菌 普通琼脂培养基 最适生长温度 37℃ 巴氏杆菌 普通琼脂培养基 最适生长温度 37℃ N-VýQ}S;SOO CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA126—2023 6附录B （资料性） 奶牛感染乳房炎档案记录表 表B.1给出了