ICS11.220 CCSB41 21 辽宁省地方标准 DB21/T3787—2023 非洲猪瘟病毒LAMP目视检测方法 Loop-mediatedIsothermalAmplification（LAMP）VisualDetection MethodforAfricanSwineFever(ASFV) 2023-07-30发布 2023-08-30实施 辽宁省市场监督管理局  发布 DB21/T3787—2023 I目次 前言..................................................................................II 1范围................................................................................1 2规范性引用文件......................................................................1 3术语和定义..........................................................................1 4缩略语..............................................................................1 5生物安全基本要求....................................................................1 6方法原理............................................................................1 7设备、试剂和材料....................................................................2 8检测步骤............................................................................2 附录A（规范性）溶液制备.............................................................4 DB21/T3787—2023 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。 本文件起草单位：辽宁省农业发展服务中心、中联瑞（北京）生物科技有限责任公司。 本文件主要起草人：兰德松、于本良、顾贵波、曹际娟、周维、赵培、葛忠源、张雅为、孙世宇、 杨作丰、刘贺、杨国丽、张春姝。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反 馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：024- 23447862。 文件起草单位通讯地址：辽宁省农业发展服务中心（沈阳市沈北新区人和街95号），联系电话： 024-88420057。 DB21/T3787—2023 1非洲猪瘟病毒LAMP目视检测方法 1范围 本文件规定了非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）LAMP目视检测方法的生物安全基本 要求，方法原理，设备、试剂和材料，检测步骤等技术内容。 本文件适用于非洲猪瘟的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪全血、脾脏、扁桃体、淋巴结、 肾脏、骨髓、拭子等样品中非洲猪瘟病毒核酸的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus） Bst：嗜热硬脂芽孢杆菌（BacillusStearothermophilus) DEPC：焦炭酸二乙酯（DiethylPyrocarbonate） EDTA-2Na：乙二胺四乙酸二钠（EthyleneDiaminetetraaceticAcidDisodium） LAMP：环介导等温扩增技术（Loop-mediatedIsothermalAmplification） RM：反应液（ReactionMaterial） 5生物安全基本要求 进行ASFV检测活动时，应按照GB19489规定执行。 6方法原理 针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，并引入环引物加快反应，在链置换DNA聚合酶的作用下， 基因模板、引物、链置换型DNA合成酶等在60℃～65℃进行恒温扩增，15min～60min左右即可实现 109倍～1010倍的核酸扩增。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与 反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，经钙黄绿素染色，呈现绿色肉眼可见的沉淀物。 DB21/T3787—2023 27设备、试剂和材料 设备 二级生物安全柜、高速台式冷冻离心机、组织研磨仪、冰箱（2℃～8℃和-20℃以下）、金属 浴或恒温水浴锅（25℃～100℃）、微量移液器（量程：0.5μL～10μL、2μL～20μL、20μ L～200μL和200μL～1000μL）。 试剂 ASFVLAMP扩增用引物、2×反应液（RM）、Bst2.0DNA聚合酶、荧光染料、阳性对照、阴性对照、 DEPC处理水。试剂的溶液制备见附录A。 材料 核酸提取试剂盒、离心管（15mL、1.5mL）、0.2mLPCR反应管、移液器吸头（10μL、200μ L、1000μL）。 8检测步骤 样品采集准备 8.1.1采样人员 符合NY/T541-2016中的规定。 8.1.2采样工具和器材 符合NY/T541-2016中的规定。 样品采集 8.2.1血液样品：按照NY/T541-2016中第6.1条中猪血液样品采集的要求进行，将采集的血液注 入含1/10体积4%EDTA-2Na溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备检。 8.2.2脏器、组织样品：按照NY/T541-2016中第6.2条和6.3条中的要求进行，将采集的病死 猪或剖杀猪主要脏器（脾脏、扁桃体、淋巴结、肾脏等）、骨髓等样品使用组织研磨仪或研钵在二级 生物安全柜内进行研磨处理后用于核酸提取。 8.2.3拭子样品：按照NY/T541-2016中相关要求进行。 样品保存、包装和废弃物处理 按照NY/T541-2016执行。 样品运输 按照NY/T541-2016执行。 DNA提取 DNA提取应在样本制备区内进行，采用商品化核酸提取试剂盒按说明书提取样本核酸，样本核酸 在-20℃以下冷冻保存备用。 DB21/T3787—2023 3 LAMP扩增反应 8.6.1体系的配制和分装 在试剂配制区进行。设所需PCR管数为n（n=待测样品数+1管阴性对照+1管阳性对照）。按n+1计算 好各试剂的使用量，按表1配制，加入1.5mL离心管中，充分混匀后，按23μL/管分装至PCR管并编号。 表1每个反应体系配制表 组分 用量 2×反应液（RM） 12.5μL FIP溶液（100μmol/L） 0.4μL BIP溶液（100μmol/L） 0.4μL F3溶液（100μmol/L） 0.05μL B3溶液（100μmol/L） 0.05μL LB溶液（100μmol/L） 0.2μL Bst2.0DNA聚合酶 1μL 荧光染料 1μL DEPC处理水 7.4μL 总体积 23μL 8.6.2加样 向上述编号的PCR管中分别加入制备的阴性对照核酸、阳性对照核酸和样本核酸各2μL，扣紧混 匀后，采用1s×3次的方式瞬时离心，之后转移至扩增区。 8.6.3PCR扩增检测 在PCR扩增区进行。将PCR反应管放入金属浴或恒温水浴锅等设备中，设置温度63℃，时间55min。 结果判定 8.7.1质量控制 自然光下，阳性对照为绿色荧光，阴性对照为橘黄色无荧光，则试验成立。 8.7.2结果判定 自然光下，看到绿色荧光、淡绿色荧光、浅绿色荧光，判为阳性；看到橘黄色无荧光，判为阴性。