ICS65.020.30 B43 团体标准 T/SDAA0067－2023 鼠伤寒沙门氏菌/肠炎沙门氏菌检测技术 DetectiontechniquesforSalmonellatyphimurium/Salmonellaenteritidis 2023－10－7发布 2023－11－6实施 山东省畜牧协会发布 全国团体标准信息平台 T/SDAA0067-2023 全国团体标准信息平台 T/SDAA0067-2023 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 的规定起草。 本文件由山东省畜牧协会提出并归口。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件起草单位：山东省动物疫病预防与控制中心(山东省人畜共患病流调监测中心)、 中华人民共和国北京海关检科院、山东农业大学、山东畜牧兽医职业学院、新泰市畜牧兽医 事业发展服务中心、山东和康源生物育种股份有限公司。 本文件主要起草人：王贵升、张鹤晓、蔺晓月、李波、李玉杰、孙淑红、解红梅、张旭、 马慧玲、汪建华、王敏。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0067-2023 全国团体标准信息平台 T/SDAA0067-2023 鼠伤寒沙门氏菌/肠炎沙门氏菌检测技术 1范围 本文件规定了鼠伤寒沙门氏菌/肠炎沙门氏菌分离培养和双重荧光PCR检测方法。 本文件适用于增菌培养物、组织脏器、排泄物（泄殖腔拭子、粪便）等样品中鼠伤寒沙 门氏菌、肠炎沙门氏菌的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期 的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括 所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4双重PCR试验原理 通过对鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌全基因组序列进行比对分析，筛选出鼠伤寒沙门 氏菌特异性基因STM4497和肠炎沙门氏菌特异性片段SdfⅠ作为鉴别靶标，设计特异性引 物和探针；最后通过特异性、灵敏性、重复性试验进行调试，修正引物、探针的设计或PCR 反应试剂的成分或PCR反应程序，最终建立鼠伤寒沙门氏菌/肠炎沙门氏菌双重荧光PCR检测 方法和标准。 5试剂或材料 除特别说明外，所用试剂均为分析纯。 5.1水，GB/T6682规定的一级水。 5.2反应液：荧光PCR反应液1000μL/管；Taq酶30μL/管；阴性对照1000μL/管； 阳性对照1000μL/管。 5.3LB液体培养基（配制方法见附录A中A.2） 5.4缓冲蛋白胨水（BPW）前增菌液（配制方法见附录A中A.3） 5.5亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液(配制方法见附录A中A.4)。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0067-2023 5.6四硫磺酸盐煌绿(TTB)增菌液(配制方法见附录A中A.5)。 5.7木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂D.3(配制方法见附录A中A.6）。 5.8阳性、阴性对照:阳性对照为鼠伤寒沙门氏菌标准株（CVCC50115）培养液、肠炎沙门 氏菌标准株(CVCC3377)培养液；阴性对照为水。 5.9细菌DNA的提取试剂盒：商品化试剂盒。 5.10试剂组分和存放条件见附录A中A.1。 6仪器设备 6.1荧光定量PCR仪。 6.2纯水仪。 6.3漩涡振荡仪。 6.4恒温培养箱：温度范围：5℃~50℃，温度均匀度：≤±1℃。 6.5高速离心机：可控温4℃、可达12000r/min以上。 6.6电子天平：感量0.001g。 6.7二级生物安全柜。 6.8恒温摇床：温度范围：5℃~50℃，振荡频率：30r/min~300r/min。 6.94℃冰箱：温控范围2℃~8℃；-20℃冰箱。 6.10微量移液器：0.5µL、2µL、100µL、1000µL及配套吸头。 6.111.5mL带盖离心管，0.1µL~0.2µL低吸附8连管及透明管盖。 7样品 选择具有典型临床症状的发病动物或疑似发病动物及病死动物，无菌取其肝脏、脾脏组 织、肠内容物、粪便以及泄殖腔拭子等样品，放置于无菌容器内，标记好组织名称和采样日 期，冷藏运送到实验室进行检测。 7.1组织样品 按照NY/T541执行。 7.2肠内容物样品 按照NY/T541执行。 7.3粪便样品 按照NY/T541执行。 7.4泄殖腔拭子样品 按照NY/T541执行。 7.5种蛋和鸭胚样品采集 随机采集种蛋，胚胎采集弱胚和死胚。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0067-2023 7.6样品的储存和运输 按照NY/T541执行。 8试验步骤 8.1沙门氏菌分离鉴定 按照GB4789.4执行，进行分离、培养，至生化试验部分，完成疑似沙门氏菌菌株的 初步鉴定。 8.2细菌基因组DNA提取 将初步鉴定为沙门氏菌的菌株用商品化试剂盒进行基因组DNA提取。提取方法按照试剂 盒说明书要求进行。 8.3特异性基因引物和探针 针对鼠伤寒沙门氏菌特异性基因STM4497和肠炎沙门氏菌特异性片段SdfⅠ作为鉴别靶 标，并根据靶标设计特异性引物和探针。引物和探针DNA序列参见附件B中B.1。 8.4双重荧光PCR扩增 用附件B.1中所列的引物和探针进行荧光PCR扩增。 25µLPCR反应体系参见附件B中B.2。 PCR程序参见附件B中B.3。 8.5结果分析条件的设定 阈值设定原则：根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线的 最高点为准。选定FAM检测通道读取肠炎沙门氏菌检测结果，选定HEX/VIC检测通道读取鼠伤 寒沙门氏菌检测结果。ABI仪器选择无荧光淬灭基团，不可选择ROX作为参比基团。 8.6质控标准 8.6.1阴性对照 无Ct值并且无扩增曲线。 8.6.2阳性对照 Ct值应≤32，并出现典型的扩增曲线。 8.6.3无效判定 如阴性和阳性对照不满足以上条件，此次实验视为无效。 全国团体标准信息平台 T/SDAA0067-2023 9结果判定 实验成立，进行结果判定。 9.1阴性 两个检测通道均无Ct值，且无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。 9.2阳性 如仅FAM检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而HEX/VIC检测通道无Ct值并且无 扩增曲线，表示样本中存在肠炎沙门菌； 如仅HEX/VIC检测通道出现特征性扩增曲线，且Ct值≤36，而FAM检测通道无Ct值并且无 扩增曲线，表示样本中存在鼠伤寒沙门氏菌； 双检测通道Ct值均≤36，且出现典型的扩增曲线，表示样品中同时含有鼠伤寒沙门氏菌 和肠炎沙门菌。 阴性对照和阳性对照结果参见附件B中B.4。 9.3复检： 任一通道Ct值＞36，且出现典型的扩增曲线的样品建议复检。复检仍出现上述结果的， 判为阳性，否则，判为阴性。 全国团体标准信息平台