ICS 65.020 .20 CCS B 05 4415 汕尾市地方标准 DB4415/T 24—2023 甘薯病毒分子检测技术规程 Technical regulations for molecular detection of sweet potato virus 2023-09-14发布 2023-10-08实施 汕尾市市场监督管理局 发布 DB4415/T 24－2023 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分:标准化文件的结构和起草规则》的规 定编写。 本文件由汕尾市市场监督管理局提出并归口。 本文件起草单位 : 汕尾市农业科学院。 本文件主要起草人 : 柯杰、熊振乾、周国昌、王聪浩、方壮东、彭远璇、范琴、叶建东、叶祥俊、 林少钦。 DB4415/T 24－2023 1 甘薯病毒分子检测 技术规程 1 范围 本文件规定了甘薯 病毒分子检测 技术规程 的术语和定义、检测对象、抽样方法、检测、结果判定以 及记录和归档 。 本文件适用于汕尾 市区域内 甘薯脱毒组培苗 、原原种、原种以及生产用种的病毒分子检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的 条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 402 脱毒甘薯种薯（苗）病毒检测技术规程 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T 2964 植物病毒检测规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 分子检测 molecular detection 以功能基因、核糖体、 ITS等区域为标靶，采用分子生物学的方法在基因水平上对物种进行鉴定。 3.2 引物 primer 指一段短的核苷酸序列。其功能是作为核苷酸聚合作用的起点，在聚合反应时，引导合成一条与模 板DNA互补的序列。 3.3 聚合酶链式反应 PCR; polymerase chain reaction 在DNA聚合酶的作用下，以母链 DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性，退火，延伸等步骤， 体外复制出与母链 DNA互补的子链 DNA的过程，是一项能快速特异性的在体外扩增目的 DNA片段的技术。 3.4 逆转录聚合酶链式反应 RT-PCR; reverse transcription polymerase chain reaction 以RNA为模板，通过反转录形成互补的 DNA序列，再以此 DNA为模板进行 PCR扩增，是一项能快速特异 性的检测目的 RNA的技术。 DB4415/T 24－2023 2 4 检测对象 4.1 DNA病毒 a）甘薯类花椰菜花叶病毒 （SPCV） b) 甘薯曲叶病（ SPLCV） 4.2 RNA病毒 a) 甘薯褪绿矮化病毒（ SPCSV） b) 甘薯羽状斑驳病毒（ SPFMV） c) 甘薯G病毒（SPVG） d) 甘薯潜隐病毒（ SPLV） e) 甘薯褪绿斑病毒（ SPCFV） f) 甘薯脉花叶病毒（ SPVMV） g) 黄瓜花叶病毒（ CMV） 5 抽样方法 抽样方法应符合SN/T 2122 和SN/T 2964 中的规定，遵循随机的原则 ，根据样品的特性和样品中可 能存在的病毒表现出的症状特点 ，确定取样方法 、取样数量 、取样工具 、保存方法等 。 对实验室检测发现疑似病毒 ，但还不能做出准确判断 ，需要更多样品进行确认时 ，需重新制定更为 合适的取样计划 ，进行再次取样 。 6 检测 6.1 聚合酶链式反应（ PCR）检测 用于检测甘薯 DNA病毒。 6.1.1 试剂及缓冲液的配置 试剂及缓冲液用水 应符合GB/T 6682 的规定， 配置按NY/T 402 附录C.1执行。 6.1.2 样品DNA的提取 样品DNA的提取按 NY/T 402 附录C.2执行。 6.1.3 对照组 以ddH2O作为检测的阴性对照。 6.1.4 引物 a）甘薯类花椰菜花叶病毒（ SPCV）: F-AGGAAATCCCAGTATTATTCAAC ，R-ATTTCTAATTTGGTTTACTAATCC ，扩增产物 922 bp； b）甘薯曲叶病（ SPLCV）： F-CCYTAGGGTTCGAGCTVTGTTCGG ，R-TTTATTAATTDTTRTGCGAATC ，扩增产物 823 bp。 6.1.5 PCR扩增 采用DNA病毒特异引物进行 PCR扩增；反应体系（ 25 μL）：样品总 DNA（约100 ng/ μL）2 μL， 2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（ 10 μmol/L）各1 μL，ddH2O补齐至25 μL；扩增条件： DB4415/T 24－2023 3 94℃ 2 min；94℃ 30 s，退火45 s，68℃ 1 min，30次循环； 68℃ 10 min；4℃ 保存；扩增产物用 于后续凝胶电泳检测。 6.1.6 PCR 产物的电泳检测 取10 μL PCR扩增产物与 1 μL 10×loading Buff er混合后， 1%琼脂糖凝胶恒压（ 120 V～150 V） 下电泳20 min～30 min，EB染色后，凝胶成像仪拍照观察。 6.2 反转录聚合酶链式反应（ RT-PCR）检测 用于检测甘薯 RNA病毒。 6.2.1 试剂及缓冲液的配置 试剂及缓冲液用水应符合 GB/T 6682 的规定，配置按 NY/T 402 附录D.1执行。 6.2.2 样品RNA的提取 样品RNA的提取按 NY/T 402 附录D.2执行。 6.2.3 对照组 以ddH2O作为检测的阴性对照。 6.2.4 引物 a）甘薯褪绿矮化病毒（ SPCSV）： F-CGGTCARATTGGAAGGT ，R-TTCGCTATCAAAGAAGTRTC ，扩增产物 304 bp； b）甘薯羽状斑驳病毒（ SPFMV）： F-GCATGGTATGARGGAGTYAA ，R-TCTTCTTCTTGCGTGGAG ，扩增产物 589 bp； c）甘薯G病毒（SPVG）： F-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG ，R-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA ，扩增产物 1191 bp； d）甘薯潜隐病毒（ SPLV）： F-GCCGAYGAAACCATCMTCGAT ，R-GTCTCYGGTATAAGACAAAAAG ，扩增产物 1076 bp； e）甘薯褪绿斑病毒（ SPCFV）： F-CTATGCTGCTCACTCAAGC ，R-TTGATTGGCCACAAGCGAAG ，扩增产物 600 bp； f）甘薯脉花叶病毒（ SPVMV）： F-GCGAATTCTCAAGCACTGAAGAAAC ，R-CTCTCGAGTTACTGCACACCTCTCATT ，扩增产物 1015 bp； g）黄瓜花叶病毒（ CMV）: F-ATGGACAAATCTRAATCAACCAG ，R-TCARACTGGGA GCACYCCWGAYGT ，扩增产物 657 bp； 6.2.5 反转录 反转录过程按 NY/T 402 附录D.3.2执行。 6.2.6 PCR 扩增 采用RNA病毒特异引物进行 PCR扩增；反应体系（ 25 μL）：合成的 cDNA 2 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（ 10 μmol/L）各1 μL，ddH2O补齐至25 μL；扩增条件： 94℃ 2 min；94℃ 30 s，退火45 s，68℃ 1 min，30次循环； 68℃ 10 min；4℃ 保存；扩增产物用于后续 凝胶电泳检测。 6.2.7 PCR 产物的电泳检测 取10 μL PCR扩增产物与 1 μL 10×loading Buffer 混合后， 1%琼脂糖凝胶恒压（ 120 V～150 V） 下电泳20 min～30 min，EB染色后，凝胶成像仪拍照观察。