11.220 CCS B 41 ICS DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/T 4000—2021 牛结核病诊断技术（γ-干扰素体外 ELISA 法） Diagnostic Technique for Bovine Tuberculosis by Interferon-gamma ELISA Assay 2021 - 02 -03 发布 江苏省市场监督管理局 2021 - 03 -03 实施 发 布 DB32/T 4000-2021 目 次 前 言 .............................................................................. Ⅱ 1 范围 ............................................................................... 1 2 规范性引用文件 ..................................................................... 1 3 术语和定义 ......................................................................... 1 4 原理 ............................................................................... 2 5 试剂及仪器 ......................................................................... 2 6 检测方法 ........................................................................... 2 7 质量控制 ........................................................................... 3 8 结果判定 ........................................................................... 4 9 安全措施 ........................................................................... 4 附录 A（资料性） 外周抗凝血培养所需材料 .............................................. 5 附录 B（资料性） 夹心 ELISA 所需试剂和材料 ............................................ 6 附录 C（资料性） 检测所需仪器 ........................................................ 7 附录 D（规范性） 检测所用试剂的配制 .................................................. 8 I DB32/T 4000-2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由扬州大学提出。 本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：扬州大学、江苏省动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：焦新安、陈祥、徐正中、潘志明、陈昌海、殷月兰。 II DB32/T 4000-2021 牛结核病诊断技术（γ-干扰素体外 ELISA 法） 1 范围 本文件规定了牛结核病诊断技术（γ-干扰素体外ELISA法）的试剂及仪器、检测方法、质量控制和 结果判定等。 本文件适用于牛结核病诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18645 动物结核病诊断技术 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 32945 牛结核病诊断 体外检测γ干扰素法 3 术语和定义 本文件没有特别需要界定的术语和定义。 4 原理 感染牛分枝杆菌的牛，其T淋巴细胞已被牛分枝杆菌致敏并产生免疫记忆。当体外再次遇到牛分枝 杆菌特异性抗原（结核菌素）刺激时，牛外周血中淋巴细胞被激活并大量释放γ-干扰素，而未被感染的 牛则不会分泌或低水平分泌γ-干扰素。通过双单克隆抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测特异性 γ-干扰素浓度水平，即可诊断牛结核病。 5 试剂及仪器 5.1 试剂 外周抗凝血培养所需材料参见附录 A。夹心 ELISA 所需试剂和材料参见附录 B。 5.2 仪器 检测所需仪器参见附录C。 1 DB32/T 4000-2021 6 检测方法 6.1 试剂配制 检测所需试剂的配制见附录D。 6.2 样品采集与处理 6.2.1 无菌采集牛尾静脉血 3 mL～4 mL，加入至含肝素锂或肝素钠的抗凝血真空管中，轻轻颠倒 2 次～ 3 次使血液和抗凝剂混合均匀。室温（22±5℃）运送至实验室并在采血后 24 h 内进行培养。 6.2.2 分装前轻轻颠倒抗凝血真空管，充分混匀血液样品。将抗凝血无菌加入至 48 孔细胞培养板， 每头牛抗凝血分装 3 孔，1.0 mL/孔（可参考表 1）。 6.2.3 在每头牛的 3 孔抗凝血样品中，分别无菌加入 67 μL PBS、67 μL 禽型 PPD 溶液和 67 μL 牛 型 PPD 溶液（可参考表 1），用微量振荡器低速充分振荡，使刺激抗原与抗凝血完全混合。 6.2.4 盖上细胞培养板盖，避免液体挥发。将含有抗凝血和刺激抗原的 48 孔细胞培养板在 37℃湿温 培养箱中孵育 16 h～24 h。 6.2.5 使用移液器小心吸取上层血浆 200 μL～300 μL，转至 1.5 mL 离心管中。吸取血浆时应尽量 避免吸入红细胞。 表 1. 抗凝血样品和刺激原加入到 48 孔细胞培养板（竖排放置） PBS A1 PBS B1 PBS C1 禽型 PPD A2 禽型 PPD B2 禽型 PPD C2 牛型 PPD A3 牛型 PPD B3 牛型 PPD C3 PBS A4 PBS B4 PBS C4 禽型 PPD A5 禽型 PPD B5 禽型 PPD C5 牛型 PPD A6 牛型 PPD B6 牛型 PPD C6 动物 7 PBS D1 禽型 PPD D2 牛型 PPD D3 PBS D4 禽型 PPD D5 牛型 PPD D6 动物 8 动物 9 PBS E1 禽型 PPD E2 牛型 PPD E3 PBS E4 禽型 PPD E5 牛型 PPD E6 动物 10 动物 11 PBS F1 PBS G1 PBS H1 禽型 PPD F2 禽型 PPD G2 禽型 PPD H2 牛型 PPD F3 牛型 PPD G3 牛型 PPD H3 PBS F4 PBS G4 PBS H4 禽型 PPD F5 禽型 PPD G5 禽型 PPD H5 牛型 PPD F6 牛型 PPD G6 牛型 PPD H6 动物 1 动物 3 动物 5 动物 13 动物 15 动物 2 动物 4 动物 6 动物 12 动物 14 动物 16 6.3 酶联免疫吸附试验 6.3.1 溶解阳性、阴性对照冻干粉，配制 1×PBST 洗涤液，按“操作注意事项”平衡其他试剂。 6.3.2 取商品化已包被有 γ-干扰素单克隆抗体的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），先加入 50 μL 样品稀释液至各孔中，再加入 50 μL 血浆样品及阳性对照、阴性对照至各孔中，轻轻振匀孔中样品， 贴上封板膜，37℃孵育 2 h。 6.3.3 弃去孔内液体。使用 1×PBST 洗涤液洗板 5 次，300 μL /孔。每次静置 1 min 后弃洗涤液，洗涤 完毕后在吸水纸上拍干。 2 DB32/T 4000-2021 6.3.4 用酶标抗体稀释液按 1：100 稀释酶标抗体（现配现用） 。在每孔中加入 100 μL 新鲜配制的酶标 抗体，贴上封板膜，37℃孵育 2 h。 6.3.5 使用 1×PBST 洗涤液洗板 5 次，300 μL /孔。每次静置 1 min 后弃洗涤液，洗涤完毕后在吸水纸 上拍干。 6.3.6 每孔加入 100 µL 底物显色液，贴上封板膜，37℃避光显色 10 min。 6.3.7 按照加入底物显色液的顺序和时间间隔每孔加入 50 µL 终止液，15 min 内在酶标仪上测定 OD450nm。 6.4 操作注意事项 6.4.1 由于本试验需要活的淋巴细胞，因此需要使细胞损伤降至最低。任何情况下不应将抗凝血贮存于 冰箱中。 6.4.2 刺激后的血浆样品如不直接进行酶联免疫吸附试验，血浆可在 2℃～8℃贮存 7 天，在-20℃可贮 存 6 个月。贮存前，每个贮存管必须用合适的盖子密封。应在样品架上标记日期、操作者的首字母、 管内容物、动物编号和牛群细节等相关信息。检测前，样品应恢复至室温并充分混匀。 6.4.3 除酶标抗体外，试剂盒使用前各组份应平衡至室温，使用后即放回 2℃～8℃。 6.4.4 不同批号试剂盒的试剂组分不得混用，使用过程中各试剂组份应避免交叉污染。 6.4.5 底物显色液避免暴露于强光和接触氧化剂。 6.4.6 终止液中含有 H2SO4，使用时注意不要接触到身体和衣物。 6.4.7 抗体包被酶标板拆封后应避免受潮或沾水（每次将剩余的抗体包被酶标板用封口袋扎紧后尽快置 于 2℃~8℃） 。 6.4.8 阳性对照和阴性对照冻干粉用灭菌纯水稀释并使用后，尽快置于 2℃～8℃保存。 6.4.9 待检血浆样品数量较多时，可先使用样品稀释液稀释完所有待检血浆，再将稀释好的血浆转移到 反应板，保证反应时间一致。 6.4.10 严格按照操作说明书要求进行，操作过程中移液、定时和洗涤等过程应精确。 7 质量控制 在判定结果前必须检查对照样品的结果，确定阴性对照和阳性对照的OD450nm值在规定范围之内： 阴性对照OD450nm值范围为0.0~0.15。 阳性对照OD450nm值范围为0.7~3.0。 如果有一条标准不符合，试验是无效的，应重新进行检测。 8 结果判定 8.1 计算每个样品 PBS 刺激组、禽型 PPD 刺激组和牛型 PPD 刺激组的 O