65.020.30 CCS B 43 ICS DB32 江 苏 省 地 方 标 准 DB 32/ T 4016—2021 羊李斯特菌病诊断技术 Diagnosis for goat and sheep listeriosis 2021 - 03 - 04 发布 江苏省市场监督管理局 2021 - 04 - 04 实施 发 布 DB32/T 4016-2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由扬州大学提出。 本文件由江苏省畜牧业标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：扬州大学、江苏省动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：殷月兰、焦新安、董永毅、陈祥、黄金林。 DB32/T 4016-2021 羊李斯特菌病诊断技术 1 范围 本文件规定了羊李斯特菌病的临床诊断、病理学诊断和实验室诊断的技术要求。 本文件适用于羊李斯特菌病的诊断。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，凡是注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用 于本文件。 GB 4789.30 食品安全国家标准 食品微生物学检验 单核细胞增生李斯特氏菌检验 GB 19489 实验室生物安全通用要求。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 李斯特菌病 listeriosis 由李斯特菌引起人和动物的一种重要的人兽共患传染病，呈散发或暴发发生，主要表现为脑膜炎、 败血症和怀孕母羊流产。 3.2 李斯特菌溶血素O listeriolysin O, LLO 单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的主要毒力因子，对真核细胞膜具有裂解活性。 4 临床诊断 单核细胞增生李斯特菌引起羊李斯特菌病的临床症状为脑膜脑炎、败血症和流产。发病初期，羊体 温升高1℃～2℃，采食、咀嚼、吞咽困难，头颈呈一侧性麻痹，弯向对侧，做转圈运动。角弓反张，昏 迷卧于一侧，直至死亡。病程短的2 d～3 d，长的1至3周或更长时间。妊娠母羊流产，羔羊常发生急性 败血症而很快死亡。 伊氏李斯特菌引起羊李斯特菌病的临床症状为胃肠炎、新生羊败血症和怀孕母羊流产，罕见病例呈 脑膜脑炎相关的临床表现。 5 病理诊断 5.1 眼观病变 DB32/T 4016-2021 眼观病变表现如下： a） 神经症状的病羊：脑及脑膜充血、水肿，脑脊液增多，稍浑浊； b） 败血症型的病羊：肝脏呈多灶性坏死，脾脏肿大，心外膜下出血； c） 流产母羊：有胎盘炎，子宫内膜和胎盘充血及广泛坏死。 5.2 组织病理学变化 血液中白细胞总数升高，单核细胞增多，炎性细胞灶及其邻近的血管周围呈套袖现象，占主导的细 胞是淋巴细胞、组织细胞、浆细胞；脑干嗜中性粒细胞液化。 6 实验室诊断 6.1 细菌学诊断 6.1.1 细菌分离和培养 无菌采取病羊的脑脊髓液、脑、肝、脾、心、肺和肾组织，置于放有冰袋的采样箱中（温度低于 10℃）于 24 h 之内运回实验室，直接涂片镜检，取样品直接接种到科玛嘉平板上于 37℃培养 24 h，同 时按照附录 A 的方法进行增菌和鉴定；或按照 GB 4789.30 推荐的方法进行增菌，转接到牛津琼脂平板 上，放置在 37℃培养，培养至 24 h 和 48 h 检查细菌培养情况。 6.1.2 菌落形态及革兰氏染色 菌落形态：李斯特菌在脑心浸液平板上培养24 h后，形成直径约为1 mm～2 mm的乳白色菌落，边 缘整齐、表面光滑、隆起度高，粘稠、易挑起（附录A中图A.1）。在科玛嘉培养基上形成的菌落呈蓝绿 色，菌落周围有白色晕环（见附录A中图A.2）。在含七叶苷的琼脂培养基（如MOX平板）上形成的菌 落呈黑色（见附录A中A.3）。 革兰氏染色镜检：革兰氏染色阳性的小杆菌，两端钝圆，排列成“V”型或并列排成栅栏状。 6.1.3 生化特性 根据菌落特征选取5个菌落，观察细菌形态及在血琼脂上培养后的溶血活性，测定细菌发酵葡萄糖、 麦芽糖、甘露醇、鼠李糖和木糖及水解七叶苷的能力。 单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌的生化特征如表1所示。 表1 李斯特菌的生化特征 菌种 单核细胞增 生李斯特菌 伊氏李斯特 菌 β-溶血反 协同溶血 应 反应 + + -** + + +*** 葡萄糖 麦芽糖 甘露醇 鼠李糖 木糖 七叶苷 + + - +* - + + - - - * 血清型4h的单核细胞增生李斯特菌不能利用鼠李糖 血清型4h的单核细胞增生李斯特菌协同溶血反应呈阳性 *** 在划线有马红球菌的血平板上呈铲型溶血（见附录A中图A.4） ** 6.1.4 毒力鉴定 将强毒菌株以1106 CFU腹腔注射小鼠后，小鼠14天内死亡。小鼠脾脏、肝脏、淋巴结、肺脏、肾 上腺、心肌、胃肠道中有较小的坏死灶。取心血、肝、脾直接做涂片，镜检出现大量呈“V”型或栅栏状 DB32/T 4016-2021 的革兰氏阳性杆菌。 6.2 分子生物学诊断 挑取细菌的菌落作为 PCR 的模板，用属特异性引物 PCR 扩增出 370 bp 的条带判定为李斯特菌属； 用单核细胞增生李斯特菌特异性引物 PCR 扩增出 660 bp 的条带判定为单核细胞增生李斯特菌；用伊氏 李斯特菌特异性引物 PCR 扩增出 1100 bp 的条带判定为伊氏李斯特菌（附录 B）。 6.3 血清学诊断 以李斯特菌溶血素 O 作为包被抗原、羊血清样品作为第一抗体、酶标兔抗羊 IgG 作为第二抗体， 建立间接 ELISA 检测的血清学方法，应用于流行病学调查，具体操作和判定方法见附录 C。 7 结果判定 综合临床诊断、病理学诊断及实验室诊断结果，报告羊是否发生李斯特菌病。患病动物表现神经症 状、败血症或流产、体温升高，血液中单核细胞增多，可疑为李斯特菌病。进一步从病死羊中分离鉴定 出单核细胞增生李斯特菌或伊氏李斯特菌，可以确诊；若未分离到李斯特菌，但患病一周后的羊血清间 接ELISA测定结果阳性，也判定羊患有李斯特菌病。 8 安全措施 按照GB 19489执行。 DB32/T 4016-2021 附 录 A （规范性） 李斯特菌的分离与鉴定 取 10 g 固体样品或 10 mL 液体样品（包括血液样品）放入 90 mL LEB 增菌液中（纱布、棉签直接 放入） ，30℃培养 16 h。然后用接种环取培养液在科玛嘉显色平板上划线，37℃培养 24 h。选取带白色 晕环的蓝绿色菌落在脑心浸液培养基（BHI）平板上纯化培养，单菌落用于后期的进一步鉴定。 图 A.1 脑心浸液培养基（BHI）上的单核细胞增生李斯特菌菌落 图 A.2 科玛嘉平板上的单核细胞增生李斯特菌菌落 DB32/T 4016-2021 图 A.3 MOX 平板上的单核细胞增生李斯特菌菌落 图 A.4 血平板上的李斯特菌与马红球菌的协同溶血试验 （图 A1、A.3 和 A.4 为伊氏李斯特菌；图 A.2 为单核细胞增生李斯特菌） DB32/T 4016-2021 附 录 B （规范性） PCR 方法鉴定李斯特菌 B.1 PCR 引物 B.1.1 李斯特菌属鉴定引物： PseF：5’-GCTGAAGAGATTGCGAAAGAAG-3’ PseR：5’-CAAAGAAACCTTGGATTTGCGG-3’ 扩增产物长度为 370 bp B.1.2 单核细胞增生李斯特菌鉴定引物： LisB：5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’ MonoA：5’-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3’ 扩增产物长度为 660 bp B.1.3 伊氏李斯特菌鉴定引物 : LisB：5’-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3’ Iva1：5’-CTACTCAAGCGCAAGCGGCAC-3’ 扩增产物长度为 1100 bp B.2 PCR 扩增 B.2.1 以细菌的基因组为模板，利用引物 PseF 和 PseR 首先对分离菌株进行李斯特菌属的鉴定。PCR 反 应体系（50 μL）：超纯水 34.6 μL，10×Buffer（含 Mg2+）5 μL，dNTP 4 μL，rTaq 酶 0.4 μL，上下游引 物各 2 μL，模板 2 μL；PCR 反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 个循环； 72 ℃ 10 min。 B.2.2 反应结束后，扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，分离株鉴定为李斯特菌属后，继续用 2 种引物（MonoA 和 LisB）和（Ival 和 LisB）分别进行种鉴定，PCR 反应体系如下： 超纯水 27.75 μL 10×PCR 缓冲液 5 μL dNTP (2.5 mM) 5 μL MonoA、Iva1 各 2 μL LisB 4 μL rTaq DNA 聚合酶 0.25 μL DNA 模板 4 μL 总的反应体系 50 μL B.2.3 在对李斯特菌进行 PCR 的过程中，若以菌落为模板做 PCR，则 DNA 模板体积为 0，以超纯水补齐 不足部分的反应体系。细菌的加入方法为：用灭菌牙签挑取菌落，转移至加有 50μL 反应混合液的 PCR DB32/T 4016-2021 管中与管壁轻轻摩擦和搅动。PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。 B.2.4 反应结束后，产物用 1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。反应的体系与条件参照李斯特菌属鉴定，其 中退火反应设为 58 ℃，1 min。用属鉴定引物 PCR 扩增出 370 bp 的条带判定为李斯特菌属；用单核细 胞增生李斯特菌鉴定引物 PCR 扩增出 660 bp 的带判定为单核细胞增生李斯特菌；用伊氏李斯特菌鉴定 引物 PCR 扩增出 1100 bp 的条带判定为伊氏李斯特菌。 B.3 结果判定 若扩增出 370 bp 左右的条带，则对应菌株鉴定为李斯特菌属的细菌，如图 B.1 泳道 1 和 2 所示。 在扩增出李斯特菌属特异性条带的前提下，若扩增出 660 bp 的条带，如图 B.2 第 1 泳道所示，则为单 核细胞增生李斯特菌；若扩增出 1100 bp 的条带，如图 B.2 第 2 泳道所示，则为伊氏李斯特菌。 图 B.1 李斯特菌属鉴定 PCR 扩增结果 图 B.2 单核细胞增生李斯特菌和伊氏李斯特菌种 PCR 扩增结果 DB32/T 4016-2021 附 录 C （规范性） 间接 ELISA 方法检测抗 LL