(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211171814.2 (22)申请日 2022.09.26 (71)申请人 浙江洛兮医疗科技有限公司 地址 313000 浙江省湖州市安吉县递铺街 道半岛中路198号2幢2 楼1号 (72)发明人 胡亮　肖致祥　邢群通　 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) G06K 9/62(2022.01) G06N 20/00(2019.01) G16H 50/20(2018.01) (54)发明名称 基于MLP构建结直肠癌血清外泌体miRNA诊 断分类器 (57)摘要 本发明涉及一种基于MLP构建结直肠癌血清 外泌体miRNA诊断分类器， 建立步骤为： 通过分析 CRC肿瘤样本和正 常样本的血清miRNA表达 数据， 得到具有差异的血清外泌体miRN； 根据特征重要 性排序和递归消除确定关键特征， 结合增量特征 选择(IFS)识别最优基因作为诊断生物标志物， 得到由4个miRNA构建的神经网络(MLP)分类器； PCA降维和样品层次聚类分析显示4个特征miRNA 能较好区分CRC患者和健康个体； 其中miR ‑654‑ 5p、 miR‑126和miR ‑10b在CRC患者中表达水平显 著高于健康 个体， 而miR ‑144在CRC患者中表 达水 平显著低于健康 个体； 此外我们利用临床血液样 本进行验证， 结果显示分类器可以准确诊断出 CRC患者； 以上结果表明4个 特征miRNA可能是CRC 的血清肿瘤标志物， 本发明为CRC早期诊断提供 了新思路。 权利要求书1页 说明书6页 附图6页 CN 115521982 A 2022.12.27 CN 115521982 A 1.一种用于诊断结肠癌的血清外泌体miRNA分类 器构建方法， 其 步骤如下： Step1： 收集结直肠癌CRC患者的血清miRNA表达数据， 筛选CRC血清中表达有差异的 miRNA； Step2： 根据CRC患者的差异miRNA表达数据对患者建立行为特征与分类之间 的联系， 根 据特征重要性 排序和递归消除确定关键特 征； Step3： 为保证样本均衡性， 进行上采样的方法进行模型训练， 并用增量特征选择IFS方 法来识别最优miRNA作为诊断生物标志 物； Step4： PCA降维分析和样品层次聚类进一步验证筛选所得的最优miRNA对健康样本及 肿瘤样本的区分度， 初步评估特 征miRNA的诊断效果； Step5： 募集结直肠癌患者与 健康参与者作为受试者， 收集受试者的临床信息及血液样 本； Step6： 提取受试者血清样本的总RNA， 逆转录获取cDNA， 采用挖掘的miRNA相应的引物 进行定量扩增； Step7： 统计分析健康与肿瘤血清样本中miRNA的相对表达结果， 绘制箱线图及受试者 工作特征曲线ROC， 评估基于miRNA构建的分类 器诊断CRC的有效性。 2.根据权利要求1所述一种用于诊断结肠癌的血清外泌体miRNA分类器构建方法， 其特 征在于， Step3中筛选出的4个最优miRNA作为CRC血清生物标志物， 分别为 miR‑654‑5p、 miR‑ 126、 miR‑10b、 miR‑144。 3.根据权利要求2所述一种用于诊断结肠癌的血清外泌体miRNA分类器构建方法， 其特 征在于， Step4中4个最优特征miRNA在样本间的相对表达情况为： miR ‑654‑5p、 miR‑126、 miR‑10b在肿瘤样 本中相对于健康样本显著上调， miR ‑144在肿瘤样 本中相对于健康样本显 著下调。 4.根据权利要求3所述一种用于诊断结肠癌的血清外泌体miRNA分类器构建方法， 其特 征在于， Step7中得到的4个最优miRNA在样本间的相对表达情况为： miR ‑654‑5p、 miR‑126、 miR‑10b在肿瘤血清样 本中相对于健康样 本显著上调， miR ‑144在肿瘤血清样 本中相对于健 康样本显著下调， 与模型 预测结果趋势相符。 5.根据权利要求1所述一种用于诊断结肠癌的血清外泌体miRNA分类器构建方法， 其特 征在于， 检测样本为血清样本 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115521982 A 2基于MLP构建 结直肠癌血清外泌体miRNA诊断分类器 【技术领域】 [0001]本发明涉及基因工程技术领域， 具体地说， 是一种基于MLP构建结直肠癌血清外泌 体miRNA诊断分类 器。 【背景技术】 [0002]结直肠癌(C RC)是常见的消化道恶性肿瘤， 具有复发频繁、 抵抗治疗和易转移等特 点， 是人类最致命的恶性肿瘤之一， 目前缺乏有效的早期诊断方法。 尽管近些年来诊断技术 和治疗技术有所提升， 但CRC预后仍不理想， 早期快速诊断对患者治疗和生存具有重要意 义， 急需开发新的诊断标志 物， 用于CRC早期诊断以改善患者预后。 [0003]肿瘤标志物是由恶性肿瘤细胞异常产生的物质， 能够反映肿瘤发生、 发展和预测 肿瘤治疗反应的一类物质。 广泛存在于癌症患者肿瘤组织、 血液和排泄物中， 能通过免疫 学、 生物学和化学等方法检测。 肿瘤标志物对于癌症早期临床诊断具有重要意义。 CEA、 CA15‑3、 CYFRA21 ‑1、 CA19‑9和CA125等血清肿瘤标志物是临床中已被发现具有诊断价值的 肿瘤标志物。 CEA、 CA15 ‑3和CYFRA21 ‑1的组合能够提高肺癌临床诊断准确性。 CEA、 CA19 ‑9、 CA125和CA15 ‑3的组合能够诊断转移性乳腺癌(MBC)， 而且不同血清标志物 的组合能用于 MBC不同亚型的临床诊断。 目前， 肿瘤诊断标志物的敏感性不佳是急需解决的问题。 近年来 研究发现miRNA在癌症发展、 诊断和预后中发挥重要作用， miRNA有可能是癌症诊断标志物 的新方向， mi RNA大量存在于人体血液中， 易收集和更好的稳定性使其成为肿瘤血清标志物 的新宠。 [0004]机器学习是现代医学非常重要的研究手段， 在生物信息学领域， 机器学习主要用 于疾病诊断标志物筛选和预后模型的构建， 在挖掘癌症诊断标志物和预后标志物等研究中 具有重大潜力。 将miRNA作为癌症诊断标志物结合机器学习构建分类器是发明癌症分类及 早期诊断的明智之举， 目前急需挖掘更多更合适的mi RNA作为分子生物标志物， 将其与机器 学习的分类程序相结合， 对于诊断方案的确定具有重要的指导 意义。 【发明内容】 [0005]鉴于此， 本 发明的目的是筛选出与可用于C RC早期诊断的血清miRNA作为生物标志 物， 通过机器学习算法构建相应的分类模型， 基于临床样本验证 分类器诊断CRC患者的有效 性。 [0006]为了达到上述目的， 本研究采用下述 技术方案实现： [0007]Step1： 收集结直肠癌(CRC)患者的血清miRNA表达数据。 以健康人的血清外泌体为 对照， 分析在CRC血清中有差异的miRNA。 [0008]Step2： 根据差异血清外泌体miRNA表达量对患者建立行为特征与分类之间的联 系， 根据特 征重要性 排序和递归消除确定关键特 征。 [0009]Step3： 为保证样本均衡性， 进行上采样的方法进行模型训练， 并用增量特征选择 (IFS)方法来识别最优miRNA作为 生物标志 物。说　明　书 1/6 页 3 CN 115521982 A 3