65.020.20 ICS B 05 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1588—2019 元宝枫组织培养育苗技术规程 Technical Regulation for Tissue Culture of Acer Truncatum Bunge 2019-01-18 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2019-04-18 实施 发 布 DB15/T 1588—2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 环境及器具灭菌 .................................................................... 1 5 培养基配制 ........................................................................ 2 6 外植体及其灭菌 .................................................................... 3 7 初代培养 .......................................................................... 4 8 增殖继代培养 ...................................................................... 4 9 生根培养 .......................................................................... 4 10 炼苗移栽 ......................................................................... 5 附录 A（资料性附录） MS 表 A.1 培养基母液配制表 ............................................ 7 MS 培养基母液配制表 ........................................................ 7 附录 B（资料性附录） 常用植物生长物质的母液配置 ...................................... 8 表 B.1 常用植物生长物质的母液配置 .................................................. 8 I DB15/T 1588—2019 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由内蒙古自治区林业和草原局提出并归口。 本标准起草单位：内蒙古和盛生态科技研究院有限公司、内蒙古农业大学、内蒙古和盛生态育林有 限公司、北京蒙树生态环境工程有限公司、赤峰市园林管理局。 本标准主要起草人：赵泉胜、赵鹏武、铁英、封卫平、斯琴毕力格、王娟、田菊、王淑杰。 II DB15/T 1588—2019 元宝枫组织培养育苗技术规程 1 范围 本标准规定了元宝枫组织培养的术语和定义、环境及器具灭菌、培养基配制、外植体及其灭菌、初 代培养、增殖继代培养、生根培养、组培苗炼苗移栽等基本内容及技术要求。 本标准适用于元宝枫组织培养技术生产。 2 规范性引用文件 下列文件对本文的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版（包括所有的修改单）适用于本文件。 LY/T 1882 林木组织培养育苗技术规程 3 术语和定义 LY/T 1882-2010界定的及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 组培瓶苗 tissue-culture container seedling 经组织培养形成、尚未出瓶（试管）的完整植株。 3.2 过滤灭菌 filter sterilization 对不耐高温的植物生长调节物质，采用孔径小于0.45 μ m 的滤网膜过滤消除杂菌的方法。 4 环境及器具灭菌 4.1 准备室消毒灭菌 经常用消毒液消毒，保持室内清洁。 4.2 接种室消毒灭菌 保持室内清洁。接种前用紫外灯照射30 min～40 min，关闭紫外灯20 min后方可进入。 4.3 培养室消毒灭菌 经常用消毒液对地面、组培架等设施进行消毒。 1 DB15/T 1588—2019 4.4 超净工作台消毒灭菌 接种前应用紫外灯照射30 min～40 min，无菌风吹40 min以上。然后用70%酒精喷洒台面及操作台 内部空间。定期清洗超净工作台的过滤膜以确保过滤膜清洁，具体方法：摘下滤膜，使用流水冲洗干净， 晾干，安装，紫外灯照射灭菌。 4.5 器具消毒灭菌 4.5.1 接种器具消毒灭菌 接种前，将接种工具用滤纸包好，置于高压灭菌锅灭菌，要求温度121 ℃、时间30 min。使用前用 酒精灯外焰灼烧20 s以上，或用接种工具灭菌器直接灭菌。 4.5.2 污染瓶消毒灭菌 用高压灭菌锅消毒，然后再清洗培养瓶。或者用75%乙醇灭菌后再清洗培养瓶。 5 培养基配制 5.1 基本培养基的选择 选择MS培养基为基本培养基。 5.2 母液的配制和保存 5.2.1 母液的配制 母液中的大量元素、铁盐、微量元素及有机成分（甘氨酸、叶酸）混合配制，肌醇单一配制，具体 参数见附录A；植物生长调节物质单一配制，见附录B。 5.2.2 母液的保存 母液配制完成后，贴上标签、注明日期，并置于4 ℃冰箱存放，在有效期内使用。使用前观察无结 晶无异色。 5.3 培养基的配制 5.3.1 准备 根据培养基成分准备好蒸馏水、蔗糖、琼脂和各类母液等试剂，同时准备好移液枪、量筒、量杯、 天平、药匙、磁力搅拌器、pH计等工具。 5.3.2 琼脂融化 加蒸馏水 700 mL/L左右，再加入5 g/L琼脂，加热搅拌使琼脂融化。 5.3.3 糖溶解 琼脂融化后，加入30 g/L蔗糖，搅拌使糖溶解。 2 DB15/T 1588—2019 5.3.4 加母液 糖溶解后，吸取母液，再根据不同培养基要求加入耐高温激素(不耐高温的激素，如吲哚丁酸（IBA）、 细胞分裂素（6-BA）等，应在培养基高压灭菌后再过滤灭菌加入)，充分搅拌。 5.3.5 定容 搅拌均匀后，加蒸馏水定容。 5.3.6 pH 值测定和调节 充分搅拌后，测定pH值，用0.1 mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH调节至pH 5.8。 5.3.7 分装 使用240 ml规格的培养瓶定量分装，每瓶分装约50 ml。分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶口。 5.3.8 封口 盖紧瓶盖，或用封口膜封口。 5.3.9 灭菌 应用高压灭菌锅进行灭菌，温度121 ℃，时间15 min～20 min。 5.3.10 冷却 灭菌后的培养基放在超净工作台冷却，待完全凝固后使用。 5.3.11 贮存 灭菌后的培养基应注明编号。在4 ℃无菌条件下贮藏备用，贮存时间不超过一个月。 6 外植体及其灭菌 6.1 外植体采集 4～5月份，晴天上午10点至下午4点之间，选采无病虫害、生长健壮幼龄植株，选取1年生枝条截取 中上部腋芽饱满的茎段作为外植体。 6.2 外植体灭菌 6.2.1 初步灭菌 将茎段用洗洁精水全面刷洗表面，之后用自来水流水冲洗 30 min，将茎段放在超净工作台上备用。 6.2.2 深度灭菌 将初步灭菌的茎段用70%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3次，再用0.5%～2%的次氯酸钠浸泡15 min，用 无菌水冲洗3次，用灭菌滤纸吸附残留水分。 6.3 外植体制备 在超净工作台内，将深度灭菌的茎段均匀切分成长度1 cm～2 cm的小段，每个小段含1个芽。 3 DB15/T 1588—2019 7 初代培养 7.1 初代培养基 初代培养选用MS + IBA 0.01 mg /L + 6-BA 1. 5 mg /L。 7.2 外植体接种 在超净工作台内，将外植体接种到预先准备好的初代培养基上，每瓶培养基均匀接种3个小段，下 部插入培养基内，芽露出，盖紧瓶盖，注明编号。 7.3 培养 将接种完毕的培养瓶置于组培架上，每30 d更换培养基1次。待无根瓶苗萌发的腋芽生长至5 cm时， 切段进行增殖继代培养。 7.4 培养环境 培养室温度在25 ℃±2 ℃，相对湿度70%～80%，光照强度1500 lx～3000 lx，光照时间16 h/d。 8 增殖继代培养 8.1 增殖培养基 培养基选用MS + IBA 0.1 mg /L +6-BA 1.0 mg /L。 8.2 增殖转接 在超净工作台内，将初代培养的无根瓶苗切成长度2 cm左右的小段，每个小段上保留有1个芽，作 为增殖继代培养的材料。每瓶培养基均接种3个小段。小段下部插入培养基内，芽露出，盖紧瓶盖，注 明编号。 8.3 培养 将接种完毕的培养瓶置于组培架上，每30 d更换培养基1次。 8.4 培养环境 培养室温度25 ℃±2 ℃，相对湿度70%～80%，光照强度1500 lx～3000 lx，光照时间16 h/d。 8.5 培养期 增殖培养期为30 d-50 d。 9 生根培养 9.1 生根培养基 选用1/2 MS + IBA 0. 1 mg /L。 4 DB15/T 1588—2019 9.2 生根转接 当增殖培养的无根瓶苗生长至2. 0 cm～3. 0 cm时，在超净工作台内，从培养基上部剪取生长健壮、 大小相近的无根瓶苗转接在生根培养基上进行生根培养，每瓶3株，插入深度为1.0 mm～1.5 mm，保持 直立。 9.3 培养方法 将转接完毕的培养瓶置于组培架上，培养20 d～45 d即可生根。尚未生根的每30 d更换培养基1次。 9.4 培养条件 培养室温度25 ℃±2 ℃；相对湿度70%～80%；光照强度1500 lx～3000 lx；光照时间为16