ICS 65.020.20 B 05 DB41 河 南 省 地 方 标 准 DB 41/T 1614—2018 单孢杂交平菇品种选育技术规程 2018 - 06 - 19 发布 河南省质量技术监督局 2018 - 09 - 19 实施 发 布 DB41/T 1614—2018 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由河南省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所。 本标准主要起草人：孔维丽、康源春、张玉亭、袁瑞奇、孔维威、胡素娟、刘芹。 本标准参加起草人：韩玉娥、段亚魁、宋志波、徐柯、崔筱、孟庆涛。 I DB41/T 1614—2018 平菇单孢杂交品种选育技术规程 1 范围 本标准规定了单孢杂交平菇品种选育技术的术语和定义、亲本选择、单核菌丝的制备、单孢杂交、 新菌株筛选、鉴定和保藏。 本标准适用于平菇单孢杂交新品种的选育。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 1003—2008 普通用途双向拉伸聚丙烯（BOPP）薄膜 GB/T 4456—2008 包装用聚乙烯吹塑薄膜 GB 5749—2006 生活饮用水卫生标准 GB/T 12728—2006 食用菌术语 GB/T 21125—2007 食用菌品种选育技术规程 NY/T 119—1989 饲料用小麦麸 NY/T 528—2010 食用菌菌种生产技术规程 NY/T 1844—2010 农作物品种审定规范 食用菌 NY 5099—2002 无公害食品 食用菌栽培基质安全技术要求 NY 5358—2007 无公害食品 食用菌产地环境条件 JC/T 479—2013 建筑生石灰 DB41/T 1211—2016 平菇发酵料栽培技术规程 DB41/T 1186—2015 平菇熟料栽培技术规程 农业部第 62 号令 《食用菌菌种管理办法》2006 年 3 术语和定义 GB/T 12728—2006 和 GB/T 21125—2007 界定的术语和定义适用于本文件。 3.1 担孢子 经核配和减数分裂后在外生于担子上形成的孢子。 3.2 单孢子分离法 通过分离单个孢子以获得真菌纯培养物的方法。 3.3 菌株 由单一细胞个体通过无性繁殖形成的纯培养物及其后代。 3.4 1 DB41/T 1614—2018 品种 人工选育或发现并改良，具备特异性、一致性、稳定性，具有符合《农业植物品种命名规定》的品 种名称。 3.5 对照品种 目前生产上常用的主栽品种。 4 亲本选择 选择生物学性状优势互补、亲缘关系较远、生态差异大、特异性差异显著的菌株为亲本。 5 单核菌丝的制备 5.1 孢子收集 挑选第一茬菇颜色均匀、菇型完整，能够代表亲本菌株生物学特性的8成熟整朵子实体为种菇，选 取其中1～2片菌盖为种菇，放置在干燥洁净与孢子颜色有差异的纸张上，折叠存放，保持环境温度 24 ℃～26 ℃，湿度55%～65%，放置12 h～18 h，即可得到孢子印。 5.2 5.2.1 单孢分离 一步稀释法 无菌针挑取 0.1 mm×0.1 mm 孢子印于灭菌后的 400 mL 无菌水内，混合均匀，吸取 1 mL 孢子混合 液移入 PDA 培养基内，旋转培养皿，使悬浮液铺满培养基表面。 5.2.2 梯度稀释法 250mL 三角瓶加入 100 mL 纯净水灭菌备用，无菌接入一环平菇孢子，摇匀。选用 4～5 支 20 ml 试 管灭菌备用，每支试管内加入 9 mL 无菌水，吸取 1 mL 孢子悬浮液加入 1 号试管内摇匀，吸取 1 mL1 -4 -6 号试管内孢子悬浮液加入 2 号试管内，稀释至 10 ～10 ，显微镜镜检，以视野内保留 4～5 个孢子为 宜，吸取 1 mL 孢子悬液移入 PDA 培养皿内，旋转培养皿，使悬浮液铺满整个皿内培养基表面。 5.3 5.3.1 单孢鉴定 插片培养 将接有孢子悬浮液的培养皿，放置于 25 ℃培养箱培养 5 d～6 d，肉眼能见孢子萌发，取灭菌后的 0.5μL～10μL 移液枪枪头，垂直对准萌发的孢子，扎取，携带培养基转入新的 PDA 培养皿内，25 ℃ 培养 7 d。萌发后的菌丝再转接至新的培养皿内，距接种点 0.5 cm 处，插入无菌盖玻片，25 ℃培养， 以 30～40 个培养皿为宜。 5.3.2 显微镜检 取洁净载玻片滴入 0.5 mL 去离子水或棉蓝染色液，取出长至盖玻片 1 cm 的菌丝，覆盖至载玻片， 去除多余水分，放置 2 min 后镜检。高倍镜头下，观察菌丝是否有锁状联合，有锁状联合现象即为双核 菌丝，保留单核菌丝。 5.4 2 单核菌丝挑选 DB41/T 1614—2018 观察平菇单核菌丝长势，大致分为 4 种类型，每个类型挑选 1～3 个单核菌丝，总量以不超过 10 个为宜。 6 单孢杂交 6.1 对峙培养 分别将两个不同亲本的单核菌丝接种于培养皿内，两者相距 1 cm，25℃培养 8 d～10 d，对峙培养 区有拮抗线，表明杂交成功。 6.2 杂合子培养 2 拮抗线两侧 1 cm 处，用接种刀切割成 0.5 mm 菌块，挑取 4～5 块菌分别转接至新的培养皿培养基 内，25 ℃培养 7 d～8 d。杂交后获得大量的杂合子，插片培养，显微镜检，保留有锁状联合的杂合 子。 6.3 杂合子鉴定 杂合子与两个亲本、杂合子之间通过拮抗试验，筛选出不同的菌株即为杂交菌株，进入初选栽培 试验。 7 菌株筛选 7.1 初选 7.1.1 菌袋制作 培养料配方：棉籽壳 98%，石灰 2%，采用 14×28cm 聚丙烯袋，菌袋质量应符合 GB/T1003-2008 要 求。一端封口，高压灭菌，无菌接种，每个菌株 10～15 袋。23℃～25℃培养，观察菌丝生长情况。 7.1.2 出菇管理 大棚出菇，保持棚内温度 10℃～28℃，空气相对湿度 75%～95%，二氧化碳浓度 600 mg/L 以下，自 然光照，一端出菇，记录出菇时间、子实体形状、颜色、出菇整齐度、抗杂性、抗病性、产量等。 7.1.3 优良菌株筛选 根据选育目标设定挑选指标，初选出颜色适宜、总产量高产、抗性强的杂交菌株，进入栽培试 验。 7.2 复筛 复试采用大棚栽培和设施化栽培，可平行进行，需要 2～3 个生产周期，每个菌株 90～100 袋（瓶）， 通常以 2 个亲本菌株为对照。 7.2.1 7.2.1.1 大棚栽培 熟料栽培 适宜周年栽培。按 DB41/T 1186—2015 的规定执行，比较参试菌株之间菌丝长势、出菇早晚、出菇 温度、抗病性、抗杂性、产量、生物学效率、子实体性状、出菇率等，筛选出综合性状超过亲本或与亲 3 DB41/T 1614—2018 本相当的杂交菌株为优良菌株。 7.2.1.2 发酵料栽培 适宜秋冬季栽培。按 DB41/T 1211—2016 的规定执行，比较参试菌株之间菌丝长势、出菇早晚、出 菇温度、抗病性、抗杂性、产量、生物学效率、子实体性状、出菇率等，筛选出综合性状超过亲本或与 亲本相当的杂交菌株为优良菌株。 7.2.2 工厂化栽培 栽培容器采用质量符合 GB/T 1003—2008 规定的 1100 ml 塑料瓶及质量符合 GB/T 1003—2008 规定 折经 18～20×38×0.005 cm 聚丙烯袋为宜，栽培原料应符合 NY 5099—2002 的规定，选用适宜的配方， 采用机械化装袋（瓶）、高压灭菌、强制降温、无菌接种、适温集中培养、后熟技术，在可控的温度、 湿度、光照强度、二氧化碳浓度条件下集中出菇管理，记录菌丝满瓶时间、出菇早晚、出菇率、一茬菇 产量、生物学特性等特征。筛选出一茬菇生物学效率大于 50%并超过亲本的菌株为优良菌株。 7.3 生产筛选 生产筛选试验一般安排 1～2 生产周期，栽培数量以 500 袋为宜，以生产上主栽品种对照品种。 7.3.1 大棚栽培 采用熟料、发酵料发酵料栽培模式，按 7.2.1.1、7.2.1.2 的规定执行，比较各个菌株间菌丝长势、 出菇时间、抗病性、抗杂性、产量、生物学效率、品质等，筛选出产量超过对照菌株或产量相当品质等 其他性状优于对照的菌株为优良菌株。 7.3.2 工厂化栽培 以现有高产、亲本菌株为对照菌株，按照 7.2.2 执行，筛选出一茬出菇率、一茬菇产量、一茬菇生 物学效率超过对照菌株即为优良菌株。 8 8.1 品种鉴定与登记 特异性鉴定 送至有检验检测资质的单位做特异性检测，具有遗传特异性的菌株为新菌株。 8.2 品种登记 通过申报、审查并获得植物新品种权保护证书。 8.3 品种鉴定 通过河南省农业厅种子管理站农作物品种鉴定要求，并获得河南省农作物品种鉴定证书。 9 菌种保藏 采用短期和长期两种保藏方式，短期保藏采用低温斜面保藏法为宜，长期保藏采用液氮冷冻保藏法 为宜。 _________________________________ 4