ICS 65.100.01 B 16 DB35 福 建 省 地 方 标 准 DB35/T 1680—2017 青枯病植物疫苗制备技术规程 Technical specification for manufacture of plant vaccine against bacterial wilt disease 2017 - 10 - 24 发布 福建省质量技术监督局 2018 - 01 - 24 实施 发 布 DB35/T 1680—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由福建省农业科学院提出。 本标准由福建省农业厅归口。 本标准起草单位：福建省农业科学院农业生物资源研究所、福建省标准化研究院。 本标准主要起草人：郑雪芳、刘波、程晓明、朱育菁、张海峰、陈德局、施璘、葛慈斌、史怀。 I DB35/T 1680—2017 青枯病植物疫苗制备技术规程 1 范围 本标准规定了青枯病植物疫苗的术语和定义、制备流程、质量检测、包装与贮存。 本标准适用于茄科作物青枯病植物疫苗的生产。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法（ISO 3696:1987，MOD） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 植物疫苗 plant vaccine 一种能诱导植物产生抗病性的新型生物制剂。 3.2 青枯病植物疫苗 plant vaccine against bacterial wilt disease 以无致病力青枯雷尔氏菌（Avirulent Ralstonia solanacearum）为功能菌株生产出的具有诱导植物产 生抗青枯病特性的诱抗制剂。 4 4.1 制备流程 菌种活化 将青枯雷尔氏菌无致病力菌株在TTC固体培养基（培养基的制备见附录A）平板涂布，30 ℃恒温培 养箱培养48 h备用。 4.2 种子液制备 将活化的菌株接种到体积分数为20%的SPA液体培养基(培养基的制备见附录A)中，温度为30 ℃、转 速170 r/min下振荡培养15 h，然后取上述培养液按10%的接种量接种到SPA液体培养基，继续振荡培养 24 h，即为种子液。 4.3 发酵培养 将配制好的SPA液体培养基加入到发酵罐进行灭菌（121 ℃、30 min），待罐内的培养基温度降低 至30 ℃后，将种子液按1%接种量接种到发酵罐进行发酵培养，发酵温度为30 ℃、搅拌转速170 r/min, 每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值为0.1，培养48 h。 1 DB35/T 1680—2017 4.4 剂型制备 4.4.1 胶悬剂制备 无菌条件下，取出发酵液至贮存罐，分别添加氯化钠和2%的琼脂液至发酵液中，配成终浓度和体积 分数分别为0.02 g/mL和2.5‰的溶液，振荡均匀至无上下分层。 4.4.2 粉剂制备 往发酵液中添加适量蔗糖和麦芽糊精至终浓度分别为0.01 g/mL和0.08 g/mL，采用喷雾干燥法进行 干燥，进风口温度为280 ℃，出风口温度90 ℃，雾化器运转频率400 r/min，进料速度5 L/h，干燥至 粉末状。 5 质量检测 5.1 胶悬剂质量检测 5.1.1 外观 浅灰色至浅黄色胶悬液体，可流动、易测量体积，存放过程中，可能出现沉淀，但经手摇动，应恢 复原状，不应有沉淀结块。 5.1.2 活菌量检测 -7 吸取1 mL的植物疫苗胶悬剂，用无菌水进行10倍系列稀释至10 ，吸取0.1 mL胶悬剂稀释液，涂布 在TTC固体培养基上，30 ℃恒温培养箱培养48 h，检查并统计培养基平板上的菌落数量，菌体数量达 9 10 cfu/mL以上，且无杂菌，判定为合格。 5.2 粉剂质量检测 5.2.1 外观 土黄色均匀疏松粉末，无可见的团块。 5.2.2 活菌量检测 -8 取1 g的植物疫苗粉剂悬浮在9 mL无菌水中，再用无菌水进行10倍系列稀释至10 ，吸取0.1 mL稀释 液，涂布在TTC培养基上，30 ℃恒温培养箱培养48 h，检查并统计培养基平板上的菌落数量，菌体数量 10 达10 cfu/g以上判定为合格。 6 包装与贮存 6.1 6.2 2 采用塑料瓶或塑料袋包装。 产品在 4 ℃～10 ℃条件下冷藏保存，有效期 2 年；在常温条件下贮存，有效期 6 个月。 DB35/T 1680—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 培养基的制备 A.1 TTC固体培养基 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride medium的制备 A.1.1 组分 10 g/L蛋白胨、1 g/L水解酪蛋白、5 g/L葡萄糖、18 g/L琼脂和0.05 g/L2,3,5-氯化三苯基四氮唑， 试剂为分析纯药品。 A.1.2 配制 A.1.2.1 将10 g蛋白胨、1 g水解酪蛋白、5 g葡萄糖、18 g琼脂用符合GB/T 6682-2008中的一级水定 容至1 L，调pH值为7.2～7.5，并在121 ℃灭菌20 min，冷却至常温后在4 ℃条件下贮存备用。 A.1.2.2 将0.05 g的2,3,5-氯化三苯基四氮唑用符合GB/T 6682-2008中的一级水定容至1 L，调pH值为 7.2～7.5，并在121 ℃灭菌5 min，冷却至常温后在4 ℃条件下贮存备用。 A.1.2.3 使用时，将A.1.2.1与A.1.2.2的溶液按200:1体积比混合。 A.2 SPA液体培养基 sucrose peptone medium制备 A.2.1 组分 20 g/L蔗糖、5 g/L蛋白胨、0.5 g/L磷酸二氢钾和0.025 g/L硫酸镁，试剂为分析纯药品。 A.2.2 配制 将符合A.1.2.1要求的组分用GB/T 6682-2008中一级水定容至1 L，调pH值为7.2～7.5，并在121 ℃ 灭菌20 min，冷却至常温后在4 ℃条件下贮存备用。 _________________________________ 3 DB35/T 1680－2017 福 建 省 地 方 标 准 青枯病植物疫苗制备技术规程 DB35/T 1680—2017 * 2017 年 11 月第一版 2017 年 11 月第一次印刷