ICS 11.220 B 41 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB22/T 2784—2017 水貂阿留申病诊断 ELISA 法 ELISA method for Aleutian mink disease diagnosis 2017 - 12 - 11 发布 吉林省质量技术监督局 2018 - 04 - 01 实施 发 布 DB22/T 2784—2017 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 和 GB/T 20001.4-2015 给出的规则起草。 本标准由吉林省畜牧业管理局提出并归口。 本标准起草单位：中国农业科学院特产研究所。 本标准主要起草人：张蕾、闫喜军、张海玲、胡博、刘昊、程悦宁、白雪、赵建军、朱言柱、吕爽、 薛向红、邓晓禹、史宁、鲁荣光、王洋、廉士珍。 I DB22/T 2784—2017 水貂阿留申病诊断 ELISA 法 1 范围 本标准规定了水貂阿留申病诊断的缩略语、原理、试剂和材料、仪器和设备、操作方法和结果判定。 本标准适用于水貂和雪貂水貂阿留申病的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AD：水貂阿留申病（Aleutian Disease） AMDV：水貂阿留申病毒（Aleutian Mink Disease Parvovirus） ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunosorbent Assay） OD值：光密度（Optical Density） TMB：四甲基乙二胺联苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine） HRP：辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase） DMSO：二甲基亚砜 （Dimethyl sulfoxide） 4 原理 用制备的水貂阿留申病毒抗原，包被聚苯乙烯微量板孔，使免疫反应在固相载体上进行。当备检血 清中有水貂阿留申病毒抗体存在时，则与固相载体上的抗原形成抗原-抗体复合物，再与酶标记的抗体 （抗貂免疫球蛋白）反应，最后通过测定酶作用底物催化后的产物，进行水貂阿留申病毒抗体的定性、 定量测定。 5 试剂和材料 除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯。蒸馏水，符合 GB/T 6682 中三级水的要求。 5.1 包被液，取 Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，用氢氧化钠溶液调 pH 至 9.6，蒸馏水定容至 1 L， 采用 0.5 μm 滤器过滤，存放于 4 ℃ 冰箱。 5.2 96 孔酶标板。 5.3 洗涤液，pH 7.4 TBST 缓冲液，取 NaCl 8.00 g，KCl 0.20 g，Tris-base 1.21 g，Tween-20 1.00 mL，用盐酸或氢氧化钠溶液调 pH 至 7.4，加蒸馏水定容至 1 L。 1 DB22/T 2784—2017 5.4 封闭液，脱脂乳 2.50 g，TBST 缓冲液定容至 50 mL。 5.5 稀释液，取封闭液用蒸馏水 20 倍稀释。 5.6 辣根过氧化物酶标记的山羊抗雪貂 IgG。 5.7 TMB 底物缓冲液，A 液：NaH2PO3· H2O ，27.60 g，加蒸馏水定容至 1 L。B 液：Na2HPO3·2H2O ， 25.60 g，加蒸馏水定容至 1 L 。取 A 液 87.70 mL，B 液 12.30 mL，混匀。 5.8 TMB 底物显色剂，取 TMB 粉 60 mg，溶于 10 mL DMSO 中。 5.9 TMB 底物显色液，TMB 底物缓冲液 10 mL，TMB 底物显色剂 100 μL，H2O2 15 μL。临用前配制。 5.10 终止液，取浓盐酸用蒸馏水 12 倍稀释。 5.11 抗原的制备见附录 A。 5.12 备检血清、阴性血清和阳性血清的制备见附录 A。 6 仪器和设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 7 酶标仪，含有 450 nm 波长的滤光片。 移液器，200 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL。 洗板机。 恒温培养箱，37 ℃。 冰箱，温控范围 0 ℃～4 ℃。 操作方法 7.1 将纯化的 AMDV 抗原（附录 A.1）用包被液(5.1)稀释至 20 μg/mL，100 μL/孔(5.2)，4 ℃ 密封 过夜。 7.2 次日用洗涤液(5.3)洗涤 3 次，加入 200 μL/孔的封闭液(5.4)，37 ℃ 孵育 2 h。 7.3 用洗涤液洗涤 3 次，加入 1:20 稀释的被检血清样品(附录 A.2)，100 μL/孔，同时设阴性血清(附 录 A.3)、阳性血清(附录 A.4)和空白对照孔（5.5），每个样品设重复孔，室温孵育 1 h。 7.4 用洗涤液洗涤 3 次，加入用稀释液(5.5)做 1:4 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗雪貂 IgG(5.6)，100 μL/孔，室温孵育 1 h。 7.5 用洗涤液洗涤 3 次，每孔加入 100 μL TMB 显色液(5.9)，室温避光显色 10 min。 7.6 最后每孔加入 100 μL 终止液(5.10)终止反应，酶标仪(6.1)读取 450 nm 处的 OD 值。 8 结果判定 8.1 有效原则 8.1.1 要求空白对照两孔平均 OD 值 ＜ 阴性对照血清两孔平均 OD 值＜ 阳性对照血清两孔平均 OD 值。 8.1.2 阳性对照血清两孔平均 OD 值（P）与阴性对照血清两孔平均 OD 值（N）之比大于或等于 2.1， 即 P/N ≥ 2.1。 8.2 8.2.1 2 判定 计算被检血清的两孔平均 OD 值和阴性对照血清的两孔平均 OD 值之比。 DB22/T 2784—2017 8.2.2 当被检血清的两孔平均 OD 值（S）与阴性对照血清的两孔平均 OD 值（N）之比大于或等于 2.1， 即 S/N ≥2.1，且 S ≥ 0.418，判定为 AD 阳性。否则为阴性。 3 DB22/T 2784—2017 AA 附 录 A （规范性附录） 抗原及血清的制备 A.1 抗原 国际标准毒株 AMDV-G 株细胞毒 4 ℃ 148 000 g 离心 2 h。弃上清，沉淀以 TBST 缓冲液溶解， 调整浓度为 1 mg/mL，-20 ℃ 冻存。 A.2 被检血清 用毛细管在水貂趾尖采血，将管两端烧融封口或者橡皮泥封口，48 h 内送检。 A.3 阴性血清 取商品化的标准阴性血清或采集健康水貂血液分离获得血清。用对流免疫电泳方法验证为 AD 抗体 阴性。 A.4 阳性血清 取商品化的标准阳性血清或用 AMDV-G 国际标准毒株免疫水貂后分离血清制成。对流免疫电泳法测 定 AD 抗体效价 1:32 以上。 ______________________ 4