ICS 67.050 X 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2851—2017 长白山林蛙油中 1-甲基海因的测定 高效液相色谱法 Determination of 1 - methylhydantoin in Ranae Oviductus from Changbai mountain High performance liquid chromatography 2017 - 12 - 11 发布 吉林省质量技术监督局 2018 - 04 - 01 实施 发 布 DB22/T 2851—2017 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省林业厅提出并归口。 本标准起草单位：吉林大学、吉林农业大学。 本标准主要起草人：王永生、李新殿、王诗涵、宋斐飞、杨怀雷、徐阳、王艳伟、崔庆艳、伊常青。 I DB22/T 2851—2017 长白山林蛙油中 1-甲基海因的测定 高效液相色谱法 1 范围 本标准规定了用高效液相色谱法对林蛙油（Ranae Oviductus）中1-甲基海因进行定性测定。 本标准适用于长白山林蛙油中1-甲基海因的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 中华人民共和国药典 2015版 一部 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 长白山林蛙油 Changbai mountain Ranae Oviductus 长白山林蛙油是主产于长白山的林蛙油，即《中华人民共和国药典》2015版一部收载的哈蟆油，为 蛙科动物中国林蛙Rana temporaria chensinensis David雌蛙的输卵管，经采制干燥而得。 4 原理 将林蛙油中1-甲基海因经过柱前衍生化处理之后，最大吸收波长红移，通过高效液相色谱法在254 nm下对其衍生化产物3-苯甲酰基-1-甲基海因进行检测，色谱条件得到了改善，分离度好，检测效果明 显。 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 试剂或材料 除特别说明外，所有试剂均为分析纯。 石油醚（混合物）； 甲醇（CH3OH）； 二氯甲烷（CH2Cl2）； 无水吡啶（C5H5N）； 苯甲酰氯（C7H5ClO）； 环己烷（C6H12）； 乙腈（C2H3N）； 3-苯甲酰基-1-甲基海因标准物质（自制，面积归一化法计算纯度大于 98%）（C11H10N2O3）； 色谱甲醇（CH3OH）； 1 DB22/T 2851—2017 5.10 超纯水（H2O）。 6 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11 6.12 6.13 6.14 6.15 6.16 6.17 6.18 6.19 6.20 6.21 7 天平（感量 0.00001 g）； 粉碎机（50 HZ～60 HZ）； 60 目筛； 具塞锥形瓶（50 mL）； 量筒（50 mL）； 超声波清洗器（40 KHZ）； 抽滤瓶（100 mL）； 滤纸； 锥形瓶（50 mL）； 圆底烧瓶（100 mL）； 旋转蒸发仪； 循环水式真空泵； 量筒（10 mL）； 磁力搅拌器； 移液管（1 mL）； 无水氯化钙干燥管； 容量瓶（1 mL）； 0.45 µm 微孔滤膜； 容量瓶（100 mL）； 高效液相色谱仪； 十八烷基键合硅胶色谱柱。 样品 长白山林蛙油。 8 试验步骤 8.1 试样制备 取干燥林蛙油适量（6.1），粉碎（6.2）后过60目筛（6.3），置于室温下保存备用。 8.2 试样提取及供试品溶液制备 8.2.1 取上述粉末 1.0 g（6.1），置于 50 mL 具塞锥形瓶（6.4）中，加石油醚（5.1）20 mL(6.5)， 超声提取 30 min（6.6），抽滤（6.7，6.8），滤液弃去，收集滤渣。 8.2.2 将上述滤渣置于 50 mL 具塞锥形瓶中（6.4），加入甲醇（5.2）20 mL(6.5)，超声处理 30 min （6.6），抽滤（6.7，6.8，6.12），收集滤液（6.9），减压浓缩得林蛙油甲醇提取膏（6.10，6.11， 6.12）。 2 DB22/T 2851—2017 8.2.3 取上述林蛙油甲醇提取膏（8.2.2），加入二氯甲烷 8 mL（5.3，6.13），无水吡啶 2 mL（5.4， 6.13），搅拌至充分溶解后（6.14），在室温下，逐滴加入苯甲酰氯 0.1 mL（5.5，6.15），无水氯化 钙干燥管封口（6.16），室温搅拌反应 1 h（6.14）。反应完毕后反应液减压浓缩（6.10，6.11，6.12）， 然后再加入环己烷（5.6）10 mL 并旋干，重复 3 次至无吡啶味。之后残渣加乙腈（5.7）定容至 1 mL 容量瓶中（6.17），用微孔滤膜滤过（6.18），取续滤液，即得林蛙油衍生后供试品溶液。 8.3 标准溶液制备 取3-苯甲酰基-1-甲基海因标准物质（5.8）10.00 mg（6.1）置于100 mL容量瓶中（6.19），加乙 腈（5.7）定容至刻度，摇匀，制成每1mL含0.1000 mg的溶液，作为标准物质溶液。 8.4 试验条件 高效液相色谱仪（6.20）；十八烷基键合硅胶色谱柱（6.21）；流动相：甲醇：水（20: 80）（5.9， -1 5.10）；流速：1.0mL·min ；检测波长：254 nm；柱温：20℃；进样量：3µL。 8.5 试样溶液测定 分别精密吸取标准物质溶液 1µL（8.3）、供试品溶液 3µ L（8.2.3），注入高效液相色谱仪，按“7.4” 项下色谱条件进行测定，记录色谱图。 9 试验数据处理 与标准品对照，在供试品溶液色谱中可见3-苯甲酰氯-1-甲基海因（即1-甲基海因衍生物）色谱峰， 且3-苯甲酰氯-1-甲基海因色谱峰分离度及峰形均良好。色谱图见附录A。 10 试验报告 试验报告应包括下列内容： ——本标准的名称和编号； ——样品的详细信息； ——试验条件； ——试验结果； ——在试验过程中观察到的任何异常现象； ——试验日期。 3 DB22/T 2851—2017 AA 附 录 A （资料性附录） 长白山林蛙油衍生后标准物质溶液和供试品溶液色谱图 图A.1 -1 3-苯甲酰氯-1-甲基海因标准物质溶液色谱图（0.1000 mg.mL ） 图A.2 供试品溶液色谱图 _________________________________ 4