ICS 07.100 C 04 DB22 吉 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2566—2016 b 型流感嗜血杆菌核酸检测 多重 PCR 法 Multiplex polymerase chain reaction method for the detection of Haemophilus 2016 - 12 - 09 发布 吉林省质量技术监督局 2017 - 03 - 01 实施 发 布 DB22/T 2566—2016 前 言 本标准根据GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2015给出的规则起草。 本标准由吉林省卫生和计划生育委员会提出并归口。 本标准起草单位：吉林省疾病预防控制中心。 本标准主要起草人：张炜煜、杨修军、王慧、刘桂华、赵薇、黄鑫、李可维。 I DB22/T 2566—2016 b 型流感嗜血杆菌核酸检测 多重 PCR 法 警示——使用本标准的人员应有正规实验室工作的实践经验，本标准并未指出所有可能的安全问 题。使用者有责任采取适当的安全和健康措施，并保证符合国家有关法规规定的条件。 1 范围 本标准规定了b型流感嗜血杆菌核酸检测多重PCR法。 本标准适用于b型流感嗜血杆菌核酸的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489-2008 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 230-2002 临床诊断中聚合酶链式反应（PCR）技术的应用 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 4 4.1 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：polymerase chain reaction，聚合酶链式反应 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸 dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷酸三磷酸 dATP：deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸 dCTP：deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸 dGTP：deoxyguanosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸 dTTP：deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸 Bp：base pair，碱基对 试剂和材料 试剂 除特别说明以外，所用试剂为分析纯或生化试剂。 4.1.1 水：应符合 GB/T 6682-2008 中一级水的规格 4.1.2 DNA 提取试剂：细菌基因组 DNA 提取试剂盒 4.1.3 10×PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾，20 mmol/L 氯化镁。 4.1.4 4 dNTP（10 mmol/L）：dATP、dCTP、dGTP、dTTP 1 DB22/T 2566—2016 4.1.5 TaqDNA 聚合酶 4.1.6 分子量标记：100 bp～2000 bp DNA 条带（DNA Ladder） 4.1.7 10×TAE 电泳缓冲液（储备液）：称取 484 g Tris，量取 114.2 mL 冰醋酸，200 mL 0.5 mol/L EDTA，溶于水中，定容至 2 L。分装后高压灭菌备用。使用前稀释成 1×TAE 电泳缓冲液（工作液）。 4.1.8 琼脂糖：电泳纯 4.1.9 溴化乙锭 4.2 质控菌株 流感嗜血杆菌ATCC9795(b 型)、 流感嗜血杆菌ATCC49247（N型）、流感嗜血杆菌ATCC10211(丢失 荚膜的b 型)。流感嗜血杆菌ATCC9795(b 型)菌体DNA作为阳性对照。 4.3 引物及探针 4.3.1 流感嗜血杆菌种属特异性引物： Hi-F：5’-ACTTTTGGCGGTTACTCTGT -3’ Hi-R：5’-TGTGCCTAATTTACCAGCAT -3 4.3.2 流感嗜血杆菌荚膜特异性引物： Hi-af-F：5’-CGTTTGTATGATGTTGATCCAGAC -3’ Hi-af-R：5’-TGTCCATGTCTTCAAAATGATG-3’ 4.3.3 b 型流感嗜血杆菌特异性引物： Hib-F：5’-GCGAAAGTGAACTCTTATCTCTC -3’ Hib-R：5’-GCTTACGCTTCTATCTCGGTGAA -3’ 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 6 PCR 仪 生物安全柜 涡旋混合器 金属浴（或水浴锅） 高压灭菌器 微量移液器：10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL 静脉采血管 冷藏冷冻冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃） 恒流电泳仪（或毛细管电泳仪） 高速离心机（13 000 rpm 以上） 凝胶成像仪（或紫外透射台） 试验步骤 6.1 6.1.1 2 样品 培养物 DB22/T 2566—2016 用接种环挑取培养基上疑似菌落，置于 200 μL 无菌双蒸水中，振荡混匀形成悬浮菌液。 6.1.2 血液 在儿童中，10 %～20 %低菌量菌血症患者是由流感嗜血杆菌引起的。采集静脉血（3 mL～5 mL）置 于含有抗凝剂的采血管中，并标记。 6.1.3 脑脊液 应由经验丰富的专业人员在无菌条件下操作。采集的脑脊液（要求1 mL）置于无菌、螺帽管中，并 标记。 6.1.4 咽拭子 将咽拭子绕过悬雍垂擦拭后壁，并置于底部滴加3～5 滴无菌生理盐水的试管中，待检。 6.2 细菌 DNA 的提取 对于上述标本，各取0.1 mL加到一个0.2 mL无菌双蒸水中，振荡混匀，100 ℃煮沸10 min，13 000 rpm/min离心10 min，吸取上清液即为DNA模版；使用细菌基因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模 板DNA。同时设阳性对照、阴性对照、空白对照，试剂对照。如不能及时检测，提取的DNA可置于-20 ℃ 保存。 PCR 扩增 6.3 6.3.1 引物： 表1 引物序列 名称 引物序列 DNA 片段 （bp） 流感嗜血杆菌种特异性引物 Hi-F：5’-ACTTTTGGCGGTTACTCTGT -3’ 273 Hi-R：5’-TGTGCCTAATTTACCAGCAT -3’ 流感嗜血杆菌荚膜特异性引物 Hi-af-F：5’-CGTTTGTATGATGTTGATCCAGAC -3’ 343 Hi-af-R:5’-TGTCCATGTCTTCAAAATGATG-3’ b 型流感嗜血杆菌特异性引物 Hib-F:5’-GCGAAAGTGAACTCTTATCTCTC -3’ 480 Hib-R:5’-GCTTACGCTTCTATCTCGGTGAA -3’ 6.3.2 PCR 反应体系 25 μL反应体系包括 10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP 2 μL，1U Taq酶，10 pmol/L引物上下游各1 μL， 模板DNA 1 μL，双蒸水补足25 μL。 6.3.3 PCR 扩增条件 94 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性1 min， 55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃ 延伸10 min，室温放置30 min。 6.4 电泳及凝胶成像 秤取2.0 g琼脂糖加入100 mL电泳缓冲液中加热，充分溶化后加入适量的溴化乙锭（0.5 μg/mL ）, 然后制成凝胶板。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。取5 μL～10 μLPCR扩增产物分 3 DB22/T 2566—2016 别和适量加样缓冲液混合后，分别加样到凝胶孔。9 V/cm恒压下电泳30 min～35 min。将电泳好的凝胶 放到凝胶成像仪或紫外透射台上观察结果，进行判断并做好试验记录。 7 结果判读 7.1 结果判定 若样品PCR扩增产物电泳出现273 bp（Hi基因片段）、343 bp（Hi-af基因片段）和480 bp（Hib基 因片段）的任意一条扩增条带或三者均出现，同时阳性对照扩增产物电泳后出现目的条带（273 bp、343 bp和480 bp），阴性对照和空白对照扩增产物电泳后没有出现目的条带，判定结果为可疑阳性。 PCR扩增产物电泳无目的扩增条带，且阳性对照扩增产物电泳后出现目的条带，阴性对照和空白对 照扩增产物电泳后没有出现目的条带，判定结果为阴性。 7.2 结果表述 如判定结果为阳性，则结果表述为“b型流感嗜血杆菌核酸检测 阳性”；如判定结果为阴性，则结果 表述为“未检出b型流感嗜血杆菌核酸”。 8 废弃物处理和防止污染的措施 8.1 检验过程中的废弃物需经 121 ℃高压灭菌 30 min 后再弃置。 8.2 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处置，并 按 GB 19489-2008 中的有关规定执行。 8.3 检验过程中防止交叉污染的措施见 WS/T 230-2002 中污染的预防和控制措施。 _________________________________ 4