ICS 01.040.67 X 04 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2562—2015 大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法 （ELISA） Determination of esterase activity in Daqu — Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 文稿版次选择 2015 - 12 - 30 发布 安徽省质量技术监督局 2016 - 01 - 30 实施 发 布 DB34/T 2562—2015 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会提出并归口。 本标准起草单位：安徽瑞思威尔科技有限公司、安徽古井贡酒股份有限公司、安徽农业大学。 本标准主要起草人：周庆伍、李安军、蒋军、汤有宏、江昌俊、梁绍勋、李晓欢、何宏魁、吴文睿、 刘国英、汪君、李红歌、马侠。 I DB34/T 2562—2015 大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法 （ELISA） 1 范围 本标准规定了大曲酯酶活力的检测 酶联免疫法。 本标准适用于大曲酯酶活力的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 酯酶活力单位 esterase activity unit 在 37℃、pH 6.0 条件下，15 min 水解α-乙酸萘酯转化为α-萘酚，每产生 1 nmol α-萘酚为 1 个酯酶 活力单位（U）。 4 原理 试样中的酯酶与微孔中包被的羧酸酯酶抗体结合，在酶标记物的作用下，形成的酶标抗体抗原复合 物与显色剂发生反应，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中酯酶活力。 5 试剂和材料 5.1 本实验所用试剂除非另有说明，均为分析纯，水为符合 GB/T 6682 二级水。 5.2 酯酶试剂盒：2～8℃冰箱中保存。 注：不同品牌的酯酶试剂盒其操作步骤可能有所不同，溶液配制和测试程序等可根据其试剂盒使用说明书略作调 整。 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 包被羧酸酯酶抗体的聚苯乙烯微量反应板。 羧酸酯酶标准品：450 U/L。 羧酸酯酶标记物。 羧酸酯酶标准品稀释液。 试样稀释液。 洗板母液。 1 DB34/T 2562—2015 5.2.7 显色剂 A。 5.2.8 显色剂 B。 5.2.9 反应终止液。 5.3 磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）：优级纯。 5.4 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）：优级纯。 5.5 氯化钠（NaCl）：优级纯。 5.6 磷酸盐缓冲溶液：pH=7.4。分别称取 0.62 g 磷酸二氢钠(5.3)、5.73 g 磷酸氢二钠(5.4)和 9 g 氯化钠(5.5)，加水溶解至 1000 mL，在 pH 计上调节溶液 pH=7.4。 5.7 羧酸酯酶标准溶液：根据酯酶试剂盒（5.2）的线性范围，用羧酸酯酶标准品稀释液（5.2.4）将 羧酸酯酶标准品（5.2.2）稀释成不同活力的标准工作溶液，每次测定现配现用。 5.8 洗涤液：将洗板母液（5.2.6）按照酯酶活力试剂盒中规定的比例用水稀释，混匀后备用。 6 仪器和设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 7 酶标仪（配备 450 nm 滤光片）。 分析天平：感量 1 mg 冷冻离心机。 振荡器。 恒温培养箱。 超声波细胞破碎仪。 pH 计。 测定步骤 7.1 粗酶液制备 7.1.1 称取 0.1～0.5 g 试样，精确到 0.001 g，置于 100 mL 烧杯中，加 50 mL 磷酸盐缓冲溶液（5.6）， 振荡 10 min。将烧杯置于超声波细胞破碎仪（6.6）中，超声探头直径 6～8 mm、超声温度 4～8℃、超 声时间 3～5 s、间歇时间 3～5 s、超声功率 300～350 W、总超声时间 5～10 min，制成试样液。 7.1.2 试样液于 4～8℃、5000 r/min 离心 10 min，取 1 mL 上清液于 250 mL 容量瓶中，加磷酸盐缓 冲溶液（5.6）至刻度，摇匀，制成粗酶液。保存过程中如有沉淀，应再次离心。 7.2 测试程序 7.2.1 以下所有操作应在 20～25℃室温下进行。 7.2.2 酶标仪测定条件：酶标仪测定波长 450 nm。 7.2.3 酯酶试剂盒（5.2）中所有的试剂的温度均应回升到室温（20～25℃）后方可使用。 7.2.4 洗板条件 7.2.4.1 人工洗板次数 5 次以上，每次注水量 250 μL。 7.2.4.2 自动洗板可以设定 5 个周期。 7.2.5 记录空白、标准品和试样在微孔板上的位置。 7.3 测定 2 DB34/T 2562—2015 7.3.1 吸取 50 μL 羧酸酯酶标准工作溶液（5.7）依次加入标准溶液孔底部。吸取 40 μL 试样稀释液 （5.2.5）加入试样孔底部，再加 10 μL 粗酶液（7.1），混合均匀。 7.3.2 封板膜封板后置于 37℃恒温培养箱（6.5）中孵育 30 min。 7.3.3 取出微量反应板，弃去液体，甩干，立即用洗涤液（5.8）按 7.2.4 条件进行洗板，每次静置 30 s 后甩掉洗涤液，在吸水纸上拍干。 7.3.4 吸取 50 μL 羧酸酯酶标记物（5.2.3）于空白孔外的每一个微孔。用封板膜密封孔口，于 37℃ 孵育 30 min。 7.3.5 按 7.3.3 步骤重复操作。 7.3.6 加入 50μL 显色剂 A（5.2.7）和 50 μL 显色剂 B（5.2.8）于每一个微孔底部，摇匀后于 37℃孵 育 30 min。 7.3.7 迅速加入反应终止液（5.2.9）50 μL 于每一个微孔底部，摇匀（此时蓝色立转黄色）。 7.3.8 将微量反应板置于酶标仪（6.1）中，在 450 nm 处用空白孔调零点，测定吸光度(加入反应终止 液后应在 15 min 内读取吸光度)。 7.4 平行试验 按以上步骤同一标准溶液、同一样品溶液进行平行试验测定。 7.5 空白试验 除不称取试样外，其它均按上述步骤进行。 8 结果计算 以吸光度值为纵坐标，酯酶的活力（U/L）为横坐标，绘制标准工作曲线。从标准工作曲线上得到 试样中相应的酯酶活力，结果按公式（1）进行计算。 ................................. (1) 式中： X———- 大曲酯酶活力，单位为活力单位/克（U/g）； C——— 从标准工作曲线上得到的试样酯酶活力，单位为活力单位/升（U/L）； V——— 试样液体积,单位为毫升(mL)； n ──── 试样液稀释倍数； m ──── 试样的质量,单位为克（g）。 注：计算结果保留 2 位有效数字。 9 精密度 重复测定结果的相对偏差不得超过 15％。 _________________________________ 3