ICS 65.020.40 B 62 DB13 河 北 省 地 方 标 准 DB 13/T 2422—2016 高山杜鹃工厂化育苗技术规程 2016 - 09 - 30 发布 河北省质量技术监督局 2016 - 12 - 01 实施 发 布 DB13/T 2422—2016 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由石家庄市质量技术监督局提出。 本标准起草单位：石家庄市农林科学研究院。 本标准主要起草人：蒋淑磊、李志斌、李国松、李振勤、白霄霞、徐立军、边光亚。 I DB13/T 2422—2016 高山杜鹃工厂化育苗技术规程 1 范围 本标准规定了高山杜鹃工厂化育苗生产的组织培养车间的设计、主要仪器设备、组培生产流程、 炼苗移栽、质量分级及包装、标志、运输等内容。 本标准适用于高山杜鹃工厂化繁育生产、管理的全过程。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T 2306-2013 花卉种苗组培快繁技术规程。 3 组培车间与育苗区设计 3.1 设计要求 3.1.1 组培车间应建在干燥、通风透光、空气清新的地点。 3.1.2 组培车间主要包括:洗涤室、药品室（称量室）、培养基配制室、灭菌室、培养基储备室、接 种室、培养室等。 3.1.3 育苗区主要包括炼苗室和温室大棚。 3.2 面积要求 不同规模的高山杜鹃组培车间与育苗区的面积要求见表1 表1 不同规模的高山杜鹃组培车间与育苗区的面积要求 2 单位：m 面积指标 名 称 年产 5 万株 年产 10 万株 年产 20 万株 组培车间 200～300 370～450 700～800 洗涤室 12～15 20～30 40～50 培养瓶晾干室 5～10 20～30 40～50 药品室 (称量室) 12～15 20～30 20～30 培养基配制室 12～15 20～30 40～60 1 DB13/T 2422—2016 表 1 不同规模的高山杜鹃组培车间与育苗区的面积要求（续） 单位：m 2 面积指标 名 4 称 年产 5 万株 年产 10 万株 年产 20 万株 灭菌室 5～10 20～30 20～30 培养基储存室 10～15 20～30 40～60 接种室 20～25 50～80 100～120 培养室 60～80 150～250 300～400 出苗室 20～30 20～30 40～50 育苗区 750～900 1500～2000 3000～3500 炼苗室 15～20 20～30 30～50 温室大棚 700～800 1000～1200 2000～3000 仪器设备及试剂 所需的仪器设备及试剂主要包括：灭菌设备、接种设备、培养设备和组培常规试剂。不同规模高 山杜鹃组培车间所需的仪器设备及试剂见表2。 表 2 不同规模高山杜鹃组培车间所需的仪器设备及试剂 数量指标 名 称 年产 5 万株株 年产 10 万株 年产 20 万株 万株 万株 万株 50 L 立式高压灭菌器 1 1 1 360 L 卧式高压蒸汽 灭菌器 0 1 2 干燥灭菌器 8 16 32 电热干燥箱 50 cm×60 cm×75 cm 1 1 1 若干 若干 若干 超净工作台（单人） 8 16 32 酒精灯 8 16 32 镊子 16 32 64 手术刀柄 16 32 64 不锈钢碟 80 160 320 空调 5 10 20 培养架 50 100 200 灭菌设备、器械 40 W 紫外灯 接种设备及器械 培养设备和培养容器 2 DB13/T 2422—2016 表 2 不同规模高山杜鹃组培车间所需的仪器设备及试剂（续） 数量指标 名 称 年产 5 万株株 年产 10 万株 年产 20 万株 组培专用托盘 万株 1500 万株 3000 万株 6000 250 mL 培养瓶 6万 12 万 24 万 0.1 mg/0～210 g 电子分析天平 1 1 1 0.01 g/0～6000 g 电子精密天平 1 1 1 pH 计 1 1 1 温度计 5 10 20 200 L 冰箱 1 2 3 电磁炉 1 2 2 双层小推车 5 10 20 1 1 1 其它 小型去离子水设备 10-100 L 试剂 WPM 基本培养基组成成分试剂和植物生长物质 玻璃器皿 烧杯、试剂瓶、量筒、容量瓶等 5 组培生产流程 5.1 品种选择与母本材料管理 5.1.1 品种选择 选 择适 应 性强 ，观 赏价值 高 的高 山杜 鹃 品种 ，例 如 ：粉 金蝶 （ Rhododendron hybrids cv 'Cosmopolitan'），红粉佳人（Rh. cv. Nova Zembla ），马缨花（Rh. Fr）。 5.1.2 母本材料管理 将高山杜鹃母本植株种植在特定区域，加强肥水管理，防治和减少植株表面附带的病虫害。 5.2 培养基选择与母液配制 5.2.1 培养基选择 以WPM和1/2 WPM为基本培养基。 5.2.2 母液的配制 制作培养基前需先配制基本培养基母液，WPM培养基母液配制比例见表3。 3 DB13/T 2422—2016 表 3 WPM 培养基母液配制 种类 成分 称取量 母液体积 配 1 升培养基 （mg） （ml） 吸取量（ml） 1000 100 1000 100 500 5 500 10 500 10 NH4NO3 4000 大 (NH4)2SO4 1320 量 MgSO4.7H2O 3700 元 KH2PO4 1700 素 KNO3 4000 K2SO4 9000 中 镁 MgSO4.7H2O 3700 CaCl2. 960 Ca(NO3)2·4H2O 5560 螯合 Na2-EDTA 3730 铁 FeSO4.7H2O 2780 量 元 钙 素 微 量 元 素 H3BO3 310 MnSO4.H2O 1115 Na2MoO4·2H2O 12.5 CuSO4.5H2O 1.25 ZnSO4·7H2O 430 肌醇 5000 维 烟酸（维生素 PP） 25 生 盐酸吡多醇 25 素 盐酸硫胺素 25 甘氨酸 100 注：母液配制应用去离子水，置于4℃左右冰箱保存，贴好标签，注明名称、配制日期。 5.3 植物生长物质的母液配制 5.3.1 植物生长物质的母液配制浓度 1.0 mg/ml，植物生长物质的母液配制方法见表 4。 表 4 植物生长物质的母液配制方法 类 别 种 类 细胞分裂素 2ip（异戊烯基腺嘌呤） 1.0 IAA（吲哚乙酸） 1.0 IBA（吲哚丁酸） 1.0 NAA（α -萘乙酸） 1.0 生长素 4 常用浓度（mg/ml） DB13/T 2422—2016 5.3.2 配制方法：先用少量 0.1 mol/L 的 NaOH 溶解，然后加蒸馏水定容。 5.3.3 保存要求：母液配制好后贴好标签，置于 4℃左右的冰箱内，保存期应不超过 2 个月。 5.4 培养基制作 5.4.1 制作 取预配母液，加入激素，充分搅拌均匀，用去离子水定容1升，加入琼脂6.5 g/L，砂糖30 g/L， 加热溶解。测pH值，用0.1 mol/L的HCl或0.1 mol/L的NaOH调节pH值至5.4～5.6。 5.4.2 分装 根据不同需要定量分装，一般要求占瓶20～25 % 的比例，分装培养基时勿将培养基沾在培养瓶瓶 口，盖好瓶盖。 5.5 高压灭菌 5.5.1 分装后的培养基应在 10 h 内通过高压蒸汽灭菌锅进行灭菌，灭菌要求 121 ℃灭菌 20 min。 5.5.2 合格的灭菌培养基，应注明灭菌日期，合格标志。 5.5.3 灭菌后的培养基应注明培养基编号及配制日期。按培养基种类和配制先后储存于培养基储藏室 内。为保证培养基质量，将配制好的培养基放置 5 d 左右观察再用，且贮存时间不应超过一个月。 5.6 外植体 从健壮植株上选取生长饱满的花蕾为外植体；也可采用茎芽为外植体。 5.6.1 材料预处理 将外植体剪取适当大小，用洗涤剂溶液浸泡并振荡5 min～10 min，然后自来水冲洗30 min。 5.6.2 外植体消毒 在超净台上将预处理后的外植体放入有盖容器中，倒入75%酒精使之没过外植体，并轻摇以除去气 泡，浸泡30 s，倒去酒精，用无菌水冲洗外植体5次。倒入0.1 % 的HgCl2使之没过外植体，根据外植体 材料的质量和大小，在HgCl2溶液中浸泡2 min ～3 min，处理过程中不断轻摇，将外植体表面的气泡除 去，灭菌结束后，倒出灭菌液，用无菌水冲洗3～5次后备用。 5.7 接种准备及外植体接种操作 接种准备和外植体接种操作规范按照《花卉种苗组培快繁技术规程》执行。 5.8 组织培养过程 5.8.1 培养室条件 培养温度为20℃～22℃，光照强度3000 lux～3500 lux，每日光照12 h。 5.8.2 初代培养基 初代培养的培养基配方为:WPM+ 2ip6.0 mg/L +白砂糖30 g/L+琼脂6.5 g/L，pH值调至5.4～5.6。 5.8.3 继代培养基 5 DB13/T 2422—2016 培养1周后，花托基部开始膨大，培养6周后，长出淡黄或浅绿光滑的愈伤组织块，继续转接在WPM+ 2ip6.0 mg/L +白砂糖30 g/L+琼脂6.5 g/L培养，长出丛生芽。 5.9 不定芽分化与增殖培养 5.9.1 不定芽分化与增殖培养基 诱导不定芽分化与增殖的培养基配方: WPM+2ip2.0 mg/L+NAA0.5 mg/L+白砂30 g/L+琼脂6.5 g/L， pH值调至5.4～5.6。 5.9.2 丛生芽切割 5.9.2.1 先打开培养瓶盖，瓶口向内，取出的丛生芽块放于有无菌盘上切割； 150 mL 的培养瓶的增 殖培养切芽接种数量 5 块/瓶。 在瓶内排放均匀、整齐。 5.9.2.2 每取一丛生芽块并完成切割和接种后，将接种盘连同切苗过程中的废弃物放到一大接种盘 内，同时更换新的无菌接种盘。 5.10 组培苗生根 将高度为2 cm～3