ICS 65.020 B 30 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 2167—2014 油菜黑胫病菌鉴定方法 Detection and identification of Leptosphaeria biglobosa (Desm.) Ces. et De Not. 文稿版次选择 2014 - 09 - 23 发布 安徽省质量技术监督局 2014 - 10 - 23 实施 发 布 DB34/T 2167—2014 前 言 本标准依据 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 本标准由安徽省农业科学院作物研究所提出并起草。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草人：荣松柏、李强生、胡宝成、江莹芬、陈凤祥、吴新杰、费维新、侯树敏、范志 雄、雷伟侠、郝仲萍。 I DB34/T 2167—2014 油菜黑胫病菌鉴定方法 1 范围 本标准规定了油菜黑胫病菌的现场和室内鉴定的依据和检测方法。 本标准适用于油菜黑胫病菌的鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 鉴定依据 油菜黑胫病菌 Leptosphaeria biglobosa (Desm) Ces. & de Not.属真菌界(Fungi)，子囊菌门 (Ascomycota) ， 座 囊 菌 纲 (Dothideomycetes) ， 格 孢 腔 菌 目 (Pleosporales) ， 格 孢 腔 菌 科 (Pleosporaceae)，小球腔菌属(Leptosphaeria)；无性态属茎点霉属Phoma lingam。 由Leptosphaeria biglobosa 病菌引起的油菜病害称为油菜黑胫病。 鉴定依据：以油菜黑胫病为害症状、病菌形态学特征、PCR 反应和致病性测试结果为鉴定依据。 4 主要仪器与用具 生物显微镜、体视显微镜、培养箱、植物生长箱、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭 菌锅、液氮罐、制冰机、PCR 仪、凝胶成像系统、电泳仪、冰箱、旋涡振荡器、电子天平（感量 0.01 g）、 烘箱、培养皿、酒精灯、解剖刀、接种针、移液器、离心管。 5 主要试剂与材料 5.1 试剂 次氯酸钠，链霉素，氨苄青霉素，商用DNA提取试剂盒或 DNA 提取试剂：Tris base， EDTA，NaCl， SDS，β-巯基乙醇，聚乙烯基吡咯烷酮（PVP），林菲罗琳；PCR 试剂：PCR buffer，Mgcl2，dNTP，Taq 酶；凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，Loading Buffer，EB。 5.2 培养基 琼脂培养基（Agar），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA- potato dextrose Agar），马铃薯葡萄糖 肉汤（PDB-potato dextrose broth）液体培养基，V8 果汁琼脂培养基。见附录A。 5.3 对照菌株 1 DB34/T 2167—2014 油菜黑胫病菌（ Leptosphaeria biglobosa (Desm) Ces. & de Not.）菌株；油菜茎基溃疡病菌 (Leptosphaeria maculans (Desm) Ces. & de Not.) 提取的DNA（L. maculans 不是必需的）。 6 现场检测 植株症状诊断——在油菜生长期进行田间症状目测踏查。 根据油菜黑胫病典型症状进行诊断。 ——子叶/叶片症状：黑色坏死斑点（由致病力弱的菌株造成）；或灰白色病斑（由致病力强的菌 株造成），病斑易破裂，有黑色小粒点（为分生孢子器）。（见附录 B，图 1、2、3） ——茎杆表面症状：早期染病茎秆部位呈灰色，病斑处有黑色的边界。后期茎秆干枯时，病斑呈灰 白色，有时灰白色病斑处有小黑点（分生孢子器）生成。（见附录 B，图 4、5） ——茎秆横截面症状：感染组织横切面有黑色部分，为茎髓组织溃疡，面积因病菌侵染程度而不同， 严重时染病植株茎基部受侵染形成腐烂。（见附录 B，图 6、7） 对于田间不能确定的，采集疑似症状的植株样本进行室内检测鉴定。 7 实验室检测 7.1 病菌的分离纯化 见附录C。 7.2 菌落培养特性和病菌形态特征鉴定 病原菌(L. biglobosa) 在PDA 平板上，菌丝呈黄色绒毛状，菌丝分枝少，菌落规则。 培养一段时间后，气生菌丝上产生黄色（或黄棕色、红棕色）液珠，且菌株间存在色素水平差异。 在衰老菌丝体上可观察到黑色小粒点（为分生孢子器），（见附录D，图1、2、3、4）；分生孢子器球 形至扁球形，深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌丝中。分生孢子为无色透明，椭圆形至纺锤形，内含 2 个油球，分生孢子大小 3～5.5 μm × 1.3～2.7 μm（见附录D，图5）。子囊壳呈球形，黑色，有孔 口，直径 360 μm～500 μm；子囊棍棒形，内有 8 个子囊孢子，（见附录D，图6）；子囊孢子长椭圆 形，具 5～8 个隔膜，黄褐色，大小（30～70）μm×（4～9）μm，（见附录D，图7）。 7.3 PCR 检测 7.3.1 病原菌基因组 DNA 的提取 见附录E。 7.3.2 PCR 检测鉴定 PCR 扩增出与 L. biglobosa 阳性对照分子量大小（440 bp）一致的单一明亮条带，判定为油菜黑 胫病菌 L. biglobosa，（见附录F）。 7.4 致病性测定 选取形态特征与 L. biglobosa 形态特征相符且 PCR 检测阳性的分离菌株，在 V8 果汁琼脂培养 7 基上培养获得分生孢子，用无菌水配置成浓度为 10 /mL 分生孢子悬浮液。选取健康感病油菜品种播 种，播种 12 天后的子叶进行分生孢子接种。接种时将子叶用灭菌针轻轻刺伤，在伤口处接种 10 μL 的 分生孢子悬浮液。将接种过的幼苗保湿 48 小时（约 100％相对湿度），期间如有新生真叶出现， 2 DB34/T 2167—2014 将其剪去，以延缓子叶衰老的时间。在接种后 7～14 d 观察子叶发病情况。子叶侵染症状的主要特 征表现为：子叶被浸染后，初现淡褐色斑，后呈灰白色，稍凹陷、易破裂，上生黑色小粒点（分生孢子 器），感染严重时导致子叶枯死。 对接种发病的子叶再做病原菌分离、培养，观察是否与 L. biglobosa 一致的形态特征，并对分离 菌进行 PCR 检测。 8 结果判定 符合L. biglobosa 为害症状，菌落培养特性和病菌形态学特征与 L. biglobosa 相符，PCR 扩增 出与 L. biglobosa 阳性对照分子量大小（440 bp）一致的单一明亮条带，且致病性测试为阳性的分离 物，判定为油菜黑胫病菌 L. biglobosa。 9 材料保存与处理 9.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。感染的黑胫病植株样品放在阴凉干燥处保存；对检出油菜黑 胫病菌的样品应保存于 4℃冰箱中，以备复核。样品保存期满后须经高压灭菌或其它有效灭活方法处理。 9.2 菌株保存与处理 分离鉴定的菌株应妥善保存，菌株在 PDA 平板培养后可于 4℃冰箱保存，每 90 d 定期继代，或 将带有菌丝的培养基块转入 30%灭菌甘油中于 -80℃保存。对不需长期保存的菌株应及时灭活处理。 9.3 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，测试的时间、地点、方法和结果等，并有实验人 员和审核人员签字。 3 DB34/T 2167—2014 AA 附 录 A （资料性附录） 培养基 A.1 琼脂培养基（Agar） 琼脂 15～20 g，加纯水 1000 mL，调至 pH 5.8，121℃高压灭菌 20 min，备用。 A.2 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose Agar，PDA） 将马铃薯去皮 200 g，切成小块，加水 1000 mL 煮沸 30 min，双层纱布过滤，滤液加 20.0 g 葡 萄糖和 20.0 g 琼脂，并加水补足至 1000 mL，121℃高压灭菌 20 min，备用。 商品 PDA 粉，其常规用量为 1000 mL 纯水中加 39 g PDA 粉，121℃高压灭菌 20 min，备用。 A.3 马铃薯葡萄糖肉（potato dextrose broth， PDB）液体培养基 商品 PDB 粉 24 g，加纯水配制成 1 L 的培养液。 A.4 V8 果汁琼脂培养基 V8 果汁 200 mL，CaCO3 2 g，琼脂 15～20 g，pH 5.8，0.05 g β-谷甾醇，加纯水补足至 1000 mL， 121℃高压灭菌 20 min，备用。 4 DB34/T 2167—2014 BB 附 录 B （资料性附录） 油菜黑胫病菌为害植株典型症状 图B.1 子叶上灰白色病斑，上生黑色小粒点（分生孢子器） 图B.2 叶片上黑色的坏死斑 图B.3 叶片上灰白色病斑，上生黑色小粒点（分生孢子器） 图B.4 早期茎秆部位病斑呈灰色，有黑色的边界 图B.5 茎秆干枯时病斑呈灰白色，灰白色病斑中可见小黑点（分生孢子器） 图B.6 病斑部位横切面可见组织患病呈黑色 图B.7 染病植株茎基部腐烂 5 DB34/T 2167—2014 CC 附 录 C （资料性附录） 病菌的分离纯化 C.1 油菜植株 将采集疑似症状的植株样本用自来水洗净，晾干组织表面的水；从油菜植株的病斑处切取大小约 0.2 × 0.2 cm 的植物组织，70％酒精浸泡 1 min，无菌水清洗 2 次，再放入 10％的次氯酸钠溶液中 表面消毒约 2 min，无菌水清洗 2～3 次，用无菌滤纸吸干表面多余水分。 C.2 油菜种子或油菜籽 将异常(变色、畸形、皱缩等)种子挑取出来，用 70％酒精浸泡 1 min，无菌水清洗 2 次，再放入 10％的次氯酸钠溶液中表面消毒约 2 min，无菌水清洗 2～3 次，用无菌滤纸吸干表面多余水分。 C.3 病菌的分离纯化 将表面消毒后的油菜种子（或油菜籽）或植物组织样品置琼脂培养基上，20℃黑暗条件下培养 3～ 5 d，样品边缘有真菌菌丝生成。无菌条件下挑取少量菌丝体，转移至添加抗生素的 PDA 培养基（添加 100 mg/L 链霉素和 50 mg/L 氨苄青霉素）上，20℃培养 5～7 d，挑取菌丝体边缘少量菌丝转移至不 含抗生素的 PDA 培养基上，培养 3～6 d，再次挑取边缘菌丝接种至 PDA 培养基，直至纯化。 6 DB34/T 2167—2014 DD 附 录 D （资料性附录） 油菜黑胫病