ICS 65.120 B 46 备案号： 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB22/T 1987—2013 饲料中己烯雌酚的测定液相色谱-质谱/质 谱法 Determination of diethylstilbestrol in feeds—LC-MS/MS method 2013 - 12 - 18 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 12 - 31 实施 发 布 DB22/T 1987—2013 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009和GB/T 20001.4—2001给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院、顺德出入境检验检疫局。 本标准起草人：刘斌、邵秋荣、史艳宇、王宇、王潇、王家旭、石金娥、李滢倩、李媛媛。 I DB22/T 1987—2013 料饲料中己烯雌酚的测定液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中己烯雌酚含量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本标准适用于饲料中己烯雌酚含量的测定。 本方法检出限为0.01 mg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 20195 动物饲料 试样的制备 3 原理 试料用乙腈提取，经阴离子固相萃取柱净化、浓缩后，液相色谱-质谱/质谱（HPLC-MS/MS）测定， 外标法定量。 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 试剂与材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T 6682规定一级水的标准。 氢氧化钠（NaOH）。 甲醇(CH3OH)。 甲酸(HCOOH)。 乙腈(CH3CN)：色谱纯。 氨水(NH4OH)：浓度 25%～28%。 氢氧化钠溶液（0.01 mol/L）：称取 0.4 g 氢氧化钠（4.1），用水定容至 1 L。 70%甲醇溶液：量取 70 mL 甲醇（4.2），用水定容至 100 mL。 氨水溶液：氨水-水（1+19，体积比）。 4.9 甲酸甲醇溶液：甲酸-甲醇（1+19，体积比）。 4.10 己烯雌酚（diethylstilbestrol）标准品：C18H20O2，CAS：56-53-1 ，纯度≥99.0%。 4.11 标准储备液（1.0 mg/mL）：准确称取 0.0100 g 己烯雌酚标准品，用甲醇定容至 10.0 mL。4 ℃ 条件下避光保存，可使用 1 个月。 4.12 标准工作液：取标准储备液（4.11）用 70%甲醇溶液（4.7）稀释，配制成浓度依次为 0.05 mg/L、 0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.50 mg/L、1.00 mg/L 的己烯雌酚标准溶液，根据需要用 2.0 mL 适当浓度的 标准溶液溶解空白样品浓缩残渣，配制成相应浓度的标准工作溶液，现用现配。 4.13 弱阴离子交换固相萃取柱：60 mg/3 mL，或相当者。 1 DB22/T 1987—2013 4.14 5 滤膜：0.22 μm，有机相。 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源。 离心机：转速≥8000 r/min。 天平：感量 0.0001 g。 超声波清洗器：40 kHz。 5.5 固相萃取装置。 5.6 氮吹仪。 6 分析步骤 6.1 试样制备 选取有代表性饲料样品至少500 g，按GB/T 20195 制备样品。 6.2 提取 称取5 g粉碎试样（精确到0.001 g）于50 mL离心管中，加入40 mL乙腈（4.4），混匀，超声提取 15 min，5000 r/min 离心10 min，上清液转移至另一50 mL离心管中；残渣中加入10 mL乙腈再次提取， 合并两次提取溶液，40℃下旋转蒸发至近干，加5 mL氢氧化钠溶液（4.6）溶解残渣，8000 r/min离心 5min，取上清液，待净化。 6.3 净化 将阴离子固相萃取柱连接于真空固相萃取装置下，先用2 mL甲醇（4.2）、2 mL水将柱子活化，将 6.2的样品上清液上柱，流速为1 mL/min，依次用1 mL氨水溶液(4.8)、0.5 mL甲醇以3 mL/min的流速淋 洗，用4 mL甲酸甲醇溶液(4.9)洗脱，流速为1 mL/min。收集洗脱液，在40℃下经氮气吹干后，用2 mL70% 甲醇溶液（4.7）溶解残渣，过0.22 μm滤膜（4.14），供HPLC-MS/MS测定。 6.4 测定 6.4.1 液相色谱参考条件： a）色谱柱：C18柱, 5 μm，150 mm×2.1 mm，或相当者； b）流动相：V（水）+ V（乙腈）= 43 + 57； c）流速：0.3 mL/min； d）进样量：5 μL； e）柱温：30 ℃ 。 6.4.2 质谱参考条件： a）离子源：电喷雾（ESI），负离子模式； b）离子喷雾电压：4 kV； c）雾化气：氮气，0.25 MPa； d）干燥器：氮气，流速10 L/min，温度325 ℃； e）扫描方式：多反应监测（MRM）； 2 DB22/T 1987—2013 f）监测离子：母离子m/z 267.1，定量子离子m/z 251.1，定性子离子m/z 237.1； g）驻留时间：0.5 s； h）脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到 检测要求；锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最优灵敏度。 6.4.3 液相色谱-质谱/质谱测定 6.4.3.1 定性测定 各检测目标化合物以保留时间和两对离子（定性离子/定量离子）所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相 对丰度进行定性。被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致，同时被 测试样中目标化合物的定性离子相对丰度与浓度接近的相同条件下得到的标准溶液谱图相比，误差不超 过表1规定的范围，则可判定样品中存在对应的被测物。 表1 定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 相对离子丰度 ＞50% 20～50% 10～20% ≤10% 允许的相对误差 ±20% ±25% ±30% ±50% 6.4.3.2 定量测定 以标准工作溶液（4.12）浓度对定量离子峰面积绘制标准曲线，待测样液中己烯雌酚的响应值应在 标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析，外标法定量。在上述色谱条件下，己烯雌 酚标准物质的多反应监测（MRM）色谱图参见附录A。 7 结果计算 测定结果可由仪器工作站自动计算，也可按式（1）计算： X = c ´ V ´1000 ....................................(1) m ´1000 式中： X ───样品中己烯雌酚的总量，单位为毫克每千克（mg/kg）； c ───由标准曲线计算得试液中己烯雌酚的浓度，单位为毫克每升（mg/L）； V ───样品最终定容体积，单位为毫升（mL）； m ───样品取样质量，单位为克（g）； 结果保留两位有效数字。 8 精密度 8.1 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 8.2 再现性 在再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 3 DB22/T 1987—2013 AA 附 录 A （资料性附录） 己烯雌酚的 MRM 质量色谱谱图 A.1 己烯雌酚标准物质MRM总离子流图和选择离子流图见图A.1。 图A.1 1.0 mg/L 己烯雌酚标准溶液 MRM 色谱图 _________________________________ 4