ICS 07.100.30 B 20 备案号： 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2052—2014 饲料中沙门氏菌测定 实时荧光 PCR 方法 Determination of salmonella in feedstuffs Real-time PCR method 2014 - 02 - 28 发布 2014 - 04 - 30 实施 吉 林省质 量 技 术监 督 局 发 布 DB22/T 2052—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准主要起草单位：吉林省产品质量监督检验院、国家农业深加工产品质量监督检验中心、中华 人民共和国吉林出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：史艳宇、刘金华、王伟、刘晓晖、赵立群、侯宇、柴竹林、张涛。 I DB22/T 2052—2014 饲料中沙门氏菌测定 实时荧光 PCR 方法 1 范围 本标准规定了饲料中沙门氏菌的实时荧光PCR检验方法。 本标准适用于饲料中沙门氏菌的快速筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 13091 饲料中沙门氏菌的检验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR real-time fluorescent PCR 实时荧光聚合酶链式反应。 3.2 Ct值 cycle threshold value 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 原理 对样品的增菌培养物进行DNA提取，通过实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅曲线，从而 对饲料中的沙门氏菌进行快速检测。 5 试剂和培养基 除特别说明以外，所有试剂均为分析纯，水为按照GB/T 6682规定的一级水。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。 5.1 引物及探针： a) 上游引物：5’-GTGAAATAATCGCCACGTCGGGCAA-3’ b) 下游引物：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’ 1 DB22/T 2052—2014 c) 探针：5’-FAM-TTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTG–TAMRA-3’ 5.2 Taq DNA 聚合酶。 5.3 dNTP：dATP（deoxyadenosine triphosphate，脱氧腺苷三磷酸）、dGTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dTTP （deoxythymidine triphosphate，脱氧胸苷三磷酸）。 5.4 细菌基因组 DNA 提取纯化试剂盒。 5.5 10×PCR 缓冲液：含 200 mmol/L Tris-HCl（pH8.4），200 mmol/L 氯化钾（KCl），15 mmol/L 氯 化镁（MgCl2）。 5.6 缓冲蛋白胨水（BPW）：按 GB/T 13091 中附录规定。 5.7 沙门氏菌质控菌株：来源于正规菌种保藏机构的标准菌株。如 CGMCC1.1859、CGMCC1.1194 等。 6 设备和材料 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 实时荧光 PCR 仪。 生物安全柜：AII 型。 恒温培养箱。 离心机：转速≥12 000 r/min。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11 6.12 6.13 高压灭菌器。 恒温水浴锅。 天平：感量 0.1g。 移液器：0.2 μL ～2 μL、2 μL～10 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL。 均质器或乳钵。 涡旋混合器。 实时荧光 PCR 反应管。 离心管：1.5 mL。 7 检测步骤 7.1 样品制备与增菌 参照GB/T 13091进行。 7.2 模板 DNA 的提取 取BPW增菌液1 mL于1.5 mL无菌离心管中，12 000 r/min离心5 min，尽量吸弃上清液，使用细菌基 因组DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。提取的DNA溶液可于-20 ℃保存。 DNA提取和纯化过程应用无菌水作为核酸提取空白对照。 7.3 DNA 浓度测定 取10 μ L DNA溶液加蒸馏水稀释至1 mL，使用核酸蛋白仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和280 nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算，当A260/A280比值在1.5~2.1之间时，适宜于PCR扩增。扩 增前将所有样品DNA调至10 ng/μ L~50 ng/μ L。 2 DB22/T 2052—2014 c= A ´ N ´ 50 .............................................................................................(1) 1000 式中： c—— DNA浓度，单位为纳克每微升（ng/μL）； A—— 260 nm处的吸光值； N—— 核酸稀释倍数。 7.4 实时荧光 PCR 检验 7.4.1 实时荧光 PCR 反应体系 10×PCR缓冲液2.5 μL、引物对（10 μmol/L）各1 μL、探针（10 μmol/L）1 μL、dNTP（10 mmol/L） 1 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL、模板DNA 2 μL、用灭菌去离子水补足体积至25 μL。 7.4.2 实时荧光 PCR 反应条件 94 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s，64 ℃退火延伸1 min，同时收集FAM荧光，共进行40个循环。 反应产物可在4 ℃保存。 不同仪器、不同Taq DNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。 检验过程中分别设空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照设为以无菌水代替DNA模板；阴性 对照采用非沙门氏菌的DNA作为实时荧光PCR反应的模板；阳性对照采用沙门氏菌DNA作为实时荧光 PCR反应的模板。 8 结果与判断 8.1 质量控制 ——空白对照：无扩增曲线，Ct 值≥40.0； ——阴性对照：无扩增曲线，Ct 值≥40.0； ——阳性对照：出现典型的扩增曲线，Ct 值应≤35.0； 否则，视为无效。 8.2 结果判定 ——Ct 值≥40.0，可判定样品实时荧光 PCR 结果为阴性。 ——Ct 值≤35.0，可判定该样品实时荧光 PCR 结果为阳性，按 GB/T 13091 进行确证。 ——35.0＜Ct 值＜40.0，此时应适当增加 DNA 模板量重做实时荧光 PCR 检测。重做结果 Ct 值≥ 40.0 者为阴性，否则实时荧光 PCR 结果为阳性，按 GB/T 13091 进行确证。 9 结果表述 9.1 实时荧光 PCR 结果阴性，可直接报告未检出沙门氏菌。 9.2 确证试验结果为检出沙门氏菌，则报告检出沙门氏菌。 9.3 确证试验结果为未检出沙门氏菌，则报告未检出沙门氏菌。 10 生物安全措施 3 DB22/T 2052—2014 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员检测沙门氏菌，所有培养物和废弃物应小心 处置，并按GB/T 27403中的有关规定执行。 11 废弃物处理和防止污染的措施 11.1 11.2 检验过程中的废弃物需经 121 ℃高压灭菌处理至少 30 min 后再弃置。 检验过程中防止交叉污染的措施按照 GB/T 27403 执行。 ________________________________ 4