ICS 65.020.30 B 41 备案号：35742-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1608—2012 牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光 RT-PCR 检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of Bovine viral diarrhea/mucosal disease 2012 - 12 - 01 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1608—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局技术中心。 本标准主要起草人：孟庆峰、王伟利、吴连鹏、王玮琳、肖成蕊、蔡阳、宋战昀、孟日增。 I DB22/T 1608—2012 牛病毒性腹泻/粘膜病病毒荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了牛病毒性腹泻/粘膜病病毒（bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVDV）荧光 RT-PCR检测方法。 本标准适用于牛病毒性腹泻/粘膜病病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值：达到阈值的循环数（Cycle Threshold） DEPC：焦碳酸乙二酯（Diethylpyrocarbonate） Taq酶：TaqDNA聚合酶（Taq DNA polymerase） RNA：核糖核酸（Ribonucleic Acid） 荧 光 RT-PCR ： 荧 光 逆 转 录 聚 合 酶 链 反 应 （ Real Time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction） 4 原理 采用TaqMan方法，比对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒基因组5'端非编码区最保守的核苷酸序列，设计 特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团（用R表示）， 3'端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团（用Q表示），它在近距离内能吸收5'端荧光基因发出的荧光信号。 PCR反应进入退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上R基团发出的荧光信号被Q 基因所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时， Taq酶的5'到3'的外切核酸酶功能将 探针降解。这样探针上的R基团游离出来，所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反 应的循环进行，PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 5 试剂和材料 除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA 酶的容器分装。 5.1 试剂 1 DB22/T 1608—2012 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 5.1.8 水：配制方法见附录 A.1。 Catrimox-1 4( Cat-14)。 酚。 三氯甲烷。 柠檬酸钠。 正丁醇。 乙酸钠。 乙醇。 5.1.9 异丙醇（-20 ℃预冷）。 5.1.10 其他试剂：AMV 反转录酶(5 U/μL)、Rnase Inhibitor(40 U/μL)、10×AMV RT PCR buffer、MgCL2(25 mM)、dNTP Mixture(各 10 mM)、EX-Taq 酶(5 U/μL)。 5.1.11 引物：根据病毒性腹泻/粘膜病病毒（BVDV）国际标准株基因序列设计合成一对特异性引物： 上游引物 5'-CCATGCCCTTAGTAGGACTAGCA-3'，下游引物 5'-AACCACTGACGACTAC CCTGTACT-3'，TaqMan 探 针（FAM）5'-CCATCCAACGAACTCACCACTGTTGC-3'（TAMRA）均配制成 20 umol/L，-20 ℃保存。 5.2 对照样品的制备 5.2.1 阳性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将牛病毒性腹泻粘膜病国际标准毒株按 10 %接 种原代牛睾丸细胞，于 37 ℃吸附 1 h 后加入维持液（见附录 A.2），37 ℃培养，待 CPE 达到 70 %时 收获病毒悬液，冻融 2 次～3 次，5 000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。 5.2.2 阴性对照样品由指定单位提供或下列方法制备：将生长良好的原代睾丸细胞，冻融 2 次-3 次， 5 000 r/min 离心 10 min，取上清液备用。 6 仪器 6.1 6.2 6.3 6.4 荧光 PCR 检测仪。 高速台式冷冻离心机（最高可达 13 000 r/min）。 微量移液器：0.5 μL～10 μL，5 μL～20 μL，20 μL～200 μL，100 μL～1000 μL。 组织匀浆器。 6.5 混匀器。 6.6 二氧化碳培养箱。 7 操作步骤 7.1 样本的处理 7.1.1 组织样品：包括肠粘膜刮取物、肾、肝、肺、淋巴结、脾、胸腺。取 2 g-5 g 组织样品切成小 块，加 5 mL-15 mL 预冷的 Hanks 平衡盐溶液匀浆 2 min，制成悬液，4 ℃ 5 000 r/min 离心取 150 μL 上清液加入 1 mLCat-14 振荡混匀。 7.1.2 液体样品：包括血清、血液（加柠檬酸盐、EDTA、肝素等）、各种拭子（鼻腔、气管和眼）、 精液。 7.1.2.1 含 EDTA 的血液：取 50 μL 加装有 1 mL1×SSC（见附录 A.3 章）溶液的离心管中，混匀，4 ℃ 12 000 r/min，离心 1 min，倒掉上清液，将沉淀物重新悬浮于残留液中，加入 500 μLCat-14 振荡混 匀。 2 DB22/T 1608—2012 7.1.2.2 含柠檬酸钠或肝素的血液：取 50 μL 加入 500 μL Cat-14 振荡混匀。 7.1.2.3 血清、精液、各种拭子悬液等液体样品：取 100 μL 加入 500 μL Cat-14 振荡混匀。 7.1.2.4 阴性和阳性对照样品：分别取 100 μL 加入 500 μL Cat-14 振荡混匀。 7.2 样本 RNA 的提取 7.2.1 将 7.1 中各种处理物立即震荡 30 s，室温放置 10 min-30 min, 4 ℃ 12 000 r/min，离心 5 min， 倒置于吸水纸上，吸去液体，瞬时离心 5 s，用带滤芯的吸头吸干残留液体，将沉淀溶于 200 μL GITC （见附录 A.4）缓冲液里，间歇振荡 5 min，置于冰上。 7.2.2 将 7.2.1 中悬浮物用 100 μL 水饱和酚和 100 μL 预冷的含 2 %正丁醇的三氯甲烷进行抽提，振 荡 30 s，4 ℃ 12 000 r/min，离心 5 min；取上清液加入 100 μL 预冷（-20 ℃）的含 2 %正丁醇的三 氯甲烷振荡 30 s，4 ℃ 12 000 r/min，离心 5 min，取上清液。 7.2.3 上清液加入 300 μL 异丙醇，-70 ℃冻存 0.5 h，或者-20 ℃至少 1 h。 7.2.4 取出后 4 ℃ 12 000 r/min，离心 5 min，用 500 μL80 %乙醇漂洗，再用 500 μL100 %预冷（-20 ℃）的乙醇漂洗。干燥后加入 50 μLDEPC 水，溶解 RNA，轻轻混匀，2 000 r/min 离心 5 s。冰上保存 备用，若放置-70 ℃可长期保存。 7.3 荧光 RT-PCR 反应 7.3.1 反应体系 用漩涡混匀器将表1中各组分混匀后瞬间离心，备用。 表1 荧光 PCR 反应体系 成分 10×AMV RT PCR buffer MgCL2(25 mM) Dntp Mixture(各 10 mM) Rnase Inhibitor(40 U/μL) AMV 反转录酶(5 U/μL) EX-Taq 酶(5 U/μL) 上游引物(20 μmol/L) 下游引物(20 μmol/L) 探针(20 μmol/L) 待检 RNA 模板 Rnase Free dH2O 总计 用量（μL） 2.5 5.0 2.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 5.0 7.0 25.0 7.3.2 反应参数 将7.3.1中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环参数设置如下： ——第一阶段，反转录 42 ℃ 30 min； ——第二阶段，预变性 92 ℃ 3 min； ——第三阶段，92 ℃ 10 s、45 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，5 个循环； ——第四阶段，92 ℃ 10 s、60 ℃ 33 s，35 个循环，荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸 时进行。 8 结果判定 3 DB22/T 1608—2012 8.1 结果分析条件设定 读取检测结果。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可根 据仪器噪音情况进行调整。 8.2 质控标准 8.2.1 阴性对照无 Ct 值并且无扩增曲线。 8.2.2 阳性对照的 Ct 值应≤28，并出现特定的扩增曲线。 8.2.3 如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，此实验视为无效。 8.3 结果描述及判定 8.3.1 阴性判定 无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无牛病毒性腹泻/粘膜病病毒核酸。 8.3.2 阳性判定 Ct值≤30，且出现特定的扩增曲线，表示样品中存在牛病毒性腹泻/粘膜病病毒核酸。 4 DB22/T 1608—2012 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 DEPC处理的双蒸水及离心管、吸头处理方法 1 000mL 双蒸馏水加 1 mLDEPC，室温放置 24 h 以上，0.105 Mpa 蒸汽高压 30 min。4 ℃或室温保 存。 离心管、吸头应放在0.1% DEPC水中浸泡24 h以上，取出烘干DEPC水后再121℃高压灭菌30 min，晾 干后使用。 A.2 维持液 DMEM培养基内含青霉素200 IU/mL，链霉素200 IU/mL，抽滤除菌。 A.3 1×SSC溶液 0.15 mol/L氯化钠（NaCl）、15 mmol/L柠檬酸钠、pH7。 A.4 GITC缓冲液 4 mol/L异硫氰酸胍、0.2 mo