ICS 11.220 B 41 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 2078—2014 鹿源结核杆菌基因分型 MLVA 法 MLVA Method for Genotyping of Mycobacterium Tuberculosis from Deer 2014 - 05 - 04 发布 吉林省技术质量监督局 2014 - 06 - 01 实施 发 布 DB22/T 2078—2014 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林农业大学、吉林省中韩动物科学研 究院。 本标准主要起草人：王春雨、杨莉、李忠平、石建平、王全凯、孙磊、宋立品、孔德鑫。 I DB22/T 2078—2014 鹿源结核杆菌基因分型 MLVA 法 1 范围 本标准规定了鹿源结核杆菌MLVA分型方法。 本标准适用于鹿源结核杆菌MLVA基因分型。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单） 适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 2025 动物检疫实验室生物安全操作规范 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MLVA: 多位点可变数目串联重复序列分析 DNA marker：脱氧核糖核酸分子标记 SDS: 十二烷基硫酸钠 PCR: 聚合酶链式反应 Tris-HCl: 三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液 EDTA：乙二胺四乙酸 生物安全要求 操作过程的生物安全措施应遵守GB 19489和SN/T 2025的有关规定。 5 原理 多位点数目可变串联重复序列分型(multiple locus VNTRs analysis，MLVA)以PCR扩增为基础，利 用PCR方法扩增散在于菌株基因组中的不同独立位点可变数目串联重复序列(VNTR)，对扩增产物进行DNA 分析确定长度，根据不同位点重复序列单拷贝长度计算出拷贝数，由不同位点拷贝数组成菌株基因型。 6 材料与试剂 6.1 实验用水：本实验用水为符合 GB/T 6682 要求双蒸水。 6.2 50 bp DNA marker 1 DB22/T 2078—2014 6.3 10 % SDS：10 g 的 SDS 粉末溶解于 70 ml 双蒸水中，定容到 100 ml。 6.4 PCR 扩增预混液 6.5 1 M Tris-HCl (pH 8.0): 称取 Tris 碱 6.06 g，加双蒸水 40 ml 溶解，滴加浓 HCl 调 pH 至 8.0， 定容至 50 ml。 6.6 0.5 M EDTA (pH 8.0): 称取 EDTA-Na2·2H2O 9.306 g，加双蒸水 35 ml，搅拌，用 NaOH 调 pH 至 8.0，定容至 50 ml。 6.7 苯酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比 25；24；1） 6.8 三氯甲烷 6.9 CTAB 裂解液：2％CTAB ，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)， 0.02 mmol/L Na2-EDTA (pH 8.0)。 6.10 CTAB 沉淀液：0.5％ CTAB， 0.04 mmol/L NaCl。 6.11 TE 缓冲液: 称取 1 M Tris-HCl (pH 8.0) 1 ml 和 0.5 M EDTA (pH 8.0) 0.2 ml，加加双蒸水定 容至 100 ml。 6.12 PCR 引物 本规程选择13个MLVA位点作为扩增位点，各位点引物见表1，引物保存于-20 ℃，临用前取出用双 蒸水稀释为10 pmol/μl，置-20 ℃保存。 表1 MLVA 位点扩增引物 位点名称 QUB-11b 序列(5'to3') CGTAAGGGGGATGCGGGAAATAGG 碱基数 24 QUB-11bb CGAAGTGAATGGTGGCAT 18 MIRU 4a GCGCGAGAGCCCGAACTGC 19 MIRU 4b GCGCAGCAGAAACGCCAGC 19 MIRU 40 MIRU 40a MIRU 40b GGGTTGCTGGATGACAACGTGT GGGTGATCTCGGCGAAATCAGATA 22 24 MIRU 31 MIRU 31a MIRU 31b ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA GTGCCGACGTGGTCTTGAT 24 19 Mtub4a Mtub4b CTTGGCCGGCATCAAGCGCATTATT GGCAGCAGAGCCCGGGATTCTTC 25 23 ETR A ETR Aa ETR Ab AAATCGGTCCCATCACCTTCTTAT CGAAGCCTGGGGTGCCCGCGATTT 24 24 Mtub30 Mtub30a Mtub30b CTTGAAGCCCCGGTCTCATCTGT ACTTGAACCCCCACGCCCATTAGTA 23 25 Mtub21 Mtub21a Mtub21b AGATCCCAGTTGTCGTCGTC CAACATCGCCTGGTTCTGTA 20 20 QUB-26a AACGCTCAGCTGTCGGAT 18 QUB-26b CGGCCGTGCCGGCCAGGTCCTTCCCGAT 28 MIRU 23a MIRU 23b CTGTCGATGGCCGCAACAAAACG AGCTCAACGGGTTCGCCCTTTTGTC 23 25 MIRU 4 Mtub4 QUB-26 MIRU 23 MIRU 39a CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC 24 MIRU 39b CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT 24 Mtub34 Mtub34a Mtub34b GGTGCGCACCTGCTCCAGATAA GGCTCTCATTGCTGGAGGGTTGTAC 22 25 MIRU 2 MIRU 2a TGGACTTGCAGCAATGGACCAACT 24 MIRU 39 2 引物名称 QUB-11ba DB22/T 2078—2014 MIRU 2b 7 TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT 22 仪器与设备 7.1 生物安全柜 7.2 7.3 7.4 7.5 7.6 7.7 8 梯度 PCR 仪 毛细管电泳分析系统 高速冷冻离心机：最高离心力可达 15000×g 以上 高压灭菌器 涡漩振荡器 移液器 操作步骤 8.1 DNA 提取 8.1.1 将结核杆菌置高压灭菌器中 121 ℃下 15 min 灭活，取 2-3 个菌落或 50 μl 菌液放入离心管中， 加入 200 μl TE 缓冲液，加 10 %SDS 至终浓度为 1 %，置 85 ℃ ～90 ℃ 水浴 10 min。 8.1.2 加入 1.0 mL CTAB 裂解液及 50 µL 蛋白酶 K 溶液，涡旋震荡 30 s 后，颠倒混合 5 次，65 ℃ 水浴过夜（12h-16h）。 8.1.3 室温 12 000 r/min 离心 10 min，取上层溶液 800 µL， 加入等体积的 Tris 饱和酚/三氯甲烷/ 异戊醇（25:24:1，v/v/v），轻轻颠倒离心管混匀，室温 12 000 r/min 离心 10 min ；取上层清液(水 相)于一新离心管中，加入等体积的三氯甲烷/异戊醇（24:1，v/v），颠倒混匀，室温 12 000 r/min 离心 10 min，取上清液 600 µL，加入 2 倍体积的 CTAB 沉淀液，混匀，室温静置 60 min。12 000 r/min 离心 15 min，弃上清液。加入 500 µL 氯化钠溶液溶解沉淀，然后加入 500 µL 三氯甲烷，振荡混匀， 12 000 r/min 离心 10 min，将上清液移至一新离心管，加入 0.6 倍体积的异丙醇，混匀，4 ℃静置 30 min ，4 ℃，12 000 r/min 离心 10 min，小心弃去上清液，向沉淀加入 500 µL 70% 冷乙醇，洗涤沉 淀，4 ℃，12 000 r/min 离心 5 min，小心倒出上清液，室温干燥后，将 DNA 溶于 50 µL 去离子水中， -20 ℃保存。也可使用等效的商品化试剂盒提取模板 DNA。 8.2 DNA 浓度和纯度的测定 取5 µL DNA溶液加二次蒸馏水稀释至1 mL，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm 和280 nm处的吸光值A260和A280。DNA的浓度按式（1）计算： c= A ´ N ´ 50 .................................(1) 1000 式中： c—— DNA 浓度，单位为微克每微升（µg/µL）； A—— 260 nm 处的吸光值； N—— 核酸稀释倍数。 8.3 PCR 反应体系 3 DB22/T 2078—2014 PCR反应体系确定为：DNA 0.5 μl、上下游引物(10 pmol/L) 各0.2 μl、PCR扩增预混液 10 μl、 双蒸水9.1 μl。 8.4 PCR 扩增 不同位点PCR扩增条件详见表2。 表2 不同 MLVA 位点 PCR 扩增反应条件 位点 MIRU4 MIRU 23 反应条件 第二步循环数 第一步 95 ℃ 15 min 40 第二步 94 ℃ 1 min， MIRU31 MIRU 39 59 ℃ 1 min MIRU40 MIRU 2 72 ℃ 1 min30 s 第三步 72 ℃ 10 min ETR A QUB-11b 第一步 95 ℃ 12 min QUB-26 第二步 94 ℃ 30 s 40 60 ℃ 1 min 72 ℃ 2 min 第三步 72 ℃ 7 min Mtub34 Mtub30 第一步 95 ℃ 15 min Mtub21 Mtub4 第二步 94 ℃ 1 min 40 50 ℃ 1 min 72 ℃ 30 s 第三步 72 ℃ 10 min 8.5 PCR 产物毛细管电泳检测 以50 bp DNA marker为标准，各位点的PCR产物经毛细管电泳检测，确定PCR产物片段大小，毛细管 电泳条件如下： 加样体积：5 μl；