ICS 11.020 C 62 备案号：35806-2013 吉 林 DB22 省 地 方 标 准 DB 22/T 1673—2012 莱姆病螺旋体的检测 荧光 PCR 法 Detection of Borrelia burgdorfe——Fluorescence PCR 2012 – 12 – 17 发布 吉林省质量技术监督局 2013 – 01 – 01 实施 发 布 DB22/T 1673—2012 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009、GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林出入境检验检疫局提出并归口。 本标准起草单位：吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心。 本标准主要起草人：刘阳、王玮琳、丁旭、孙舒、刘韬、刘金华、牛茜、罗雁非、郑旭。 I DB22/T 1673—2012 莱姆病螺旋体的检测 荧光PCR法 警告——为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行检测。培养物和废物应小心处 置，并按 GB/T 19489 中的有关规定执行。 1 范围 本标准规定了莱姆病螺旋体荧光PCR检测方法 本标准适用于莱姆病螺旋体的实验室检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的 版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 19489 实验室 生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR:聚合酶链反应（Polymerase chain reaction）。 DNA:脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid）。 Taq酶:DNA聚合酶。 FAM:6-羧基-荧光素（一种荧光报告基团）（6-carboxy-fluorescein）。 MGB:小沟结合物（一种荧光淬灭基团）(Minor groove binder) 。 SDS:十二烷基硫酸钠 (Sodium dodecyl sulfate) 。 CTAB:十六烷基三乙基溴化铵（Hexadecyltrimethyl ammonium bromide）。 TE:缓冲液 (Tris-Cl EDTA) 。 Tm值:核酸融解温度（Melting tempreture）。 Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数 (Cycle threshold) 。 4 原理 实时荧光PCR方法，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个PCR进程， 最后通过荧光信号的增幅情况来判定反应结果。PCR反应体系中加入一对引物的同时加入一条特异性荧 光探针，探针两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团，PCR扩增时，利用Taq酶的水解作用，使探针 上的荧光报告基团远离淬灭基团而发出荧光信号，荧光检测系统可接收到荧光信号，此方法检测的是积 累荧光。MGB探针（Minorgroove binder oligodeoxynucleotide conjugate,MGB-ODN)，5′端标记FAM 荧光素为报告基团，3′端采用了非荧光性的淬灭基团，吸收报告基团的能量后并不发光，降低了本底 信号的干扰。此外，MGB探针的3′端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽( Dehydrocyclopyrroindole tripetide, DPI3)，可以稳定探针与模板的杂交, 升高探针Tm 值, 使较短的探针同样能达到较高的Tm 值。 1 DB22/T 1673—2012 5 试剂与材料 除另有说明以外，所用试剂均为分析纯或生化试剂，所用水为符合GB/T 6682 中规定的二级水。 5.1 试剂配制 见附录A。 5.2 引物及探针 上游引物：5′–GCTGTAAACGATGCACACTTGGT-3′ 下游引物：5′-GGCGGCACACTTAACACGTTAG-3′ 探针：6-FAM-TTCGGTACTAACTTTTAGTTAA-MGBNFQ 5.3 质控品 空白对照：以水代替DNA模板。 阴性对照：非目标菌的DNA作为荧光PCR反应的模板。 阳性对照：莱姆病螺旋体标准株ATCC 35210 DNA作为荧光PCR反应的模板。 6 仪器设备 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 7 荧光定量 PCR 仪。 生物安全柜。 高压灭菌锅。 高速台式冷冻离心机：离心速度 12000 r/min 以上。 组织匀浆仪。 涡旋混合器。 低温冰箱（-80 ℃）、冷藏冷冻冰箱（2 ℃～8 ℃和-20 ℃）。 微量可调移液器（2.5 μL、10 μL、100 μL、1000 μL）。 恒温水浴箱：室温～100 ℃。 微量离心管：1.5 mL。 试样制备 7.1 蜱 取单只活蜱,用 70%乙醇浸泡,生理盐水清洗3次,滤纸吸干后。将单只蜱放入1.5 mL离心管中，加入 500μL TE缓冲液，用匀浆仪研碎。匀浆液10000 r/min, 离心2 min，弃上清，沉淀备用。 7.2 血液 500 μL EDTA抗凝血液中加入1 mL无菌水 ,5000 r/ min,离心2min，弃上清，沉淀备用。新鲜血样 品如不能立即用于抽提DNA,可置于4 ℃保存,但不要超过2个月,欲长期储存,分装-20 ℃储存。 7.3 2 组织 DB22/T 1673—2012 25 mg～30 mg动物组织(新鲜或冷冻组织均可), 放入1.5 mL离心管中,加入 500 μL TE缓冲液, 用 匀浆仪研碎。匀浆液10000 r/min, 离心2min，弃上清，沉淀备用。 8 检测程序 8.1 样品 DNA 提取 在上述样品沉淀中加入560μL TE缓冲液，反复吹打使之重悬，加入30μL的10% SDS和3μL蛋白酶K （20 mg/mL），混匀，37 ℃孵育1h；加入100 μL 5 mol/L NaCl,充分混匀，再加入80 μL CTAB/ NaCl 溶液，混匀，65 ℃温育10 min；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000 r/min 离心5 min，将上清 转入一新离心管中；加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，10000 r/min 离心15 min,去 上清；75%乙醇洗一次，去上清，干燥，加入50μL的TE缓冲液溶解DNA备用（如不能及时检验，可将上 清液于-20 ℃保存；-70 ℃可长期保存）。 也可使用商业化的DNA提取试剂盒提取。 8.2 荧光 PCR 检测 反应体系总体积为25 μL，其中含： TaqMan Mix缓冲液 12.5 μL、引物（10 μmol/L）各1 μL、探 针（5 μmol/L）1 μL、模板DNA 5 μL、水4.5 μL。 将加样后的PCR管放入荧光PCR仪内，记录样本摆放顺序。反应参数设置如下： ——第一阶段，50 ℃ 2min； ——第二阶段，92 ℃ 10min； ——第三阶段，95 ℃ 15 s、63 ℃ 60 s，50 个循环；荧光收集设置在第三阶段 63 ℃ 60 s 时进 行。 不同仪器、不同Taq DNA聚合酶可根据要求将反应条件做适当调整。 9 结果判定及报告 9.1 结果分析条件设定 直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩 增曲线的最高点为准。 9.2 质控标准 9.2.1 检验过程中分别设空白对照、阴性对照、阳性对照。 9.2.2 空白对照、阴性对照无 Ct 值，并且无扩增曲线。 9.2.3 阳性对照的 Ct 值应小于 35.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。 9.3 结果描述及判定 9.3.1 阴性 无Ct值并且无扩增曲线，报告莱姆病螺旋体核酸检测结果阴性。 9.3.2 阳性 Ct值小于或等于35.0时，报告莱姆病螺旋体核酸检测结果阳性。 3 DB22/T 1673—2012 9.3.3 有效原则 检验样本 Ct值大于35.0且小于40.0时，建议重复检测一次，如果Ct值仍小于40.0，且曲线有明显 的对数增长期，可报告莱姆病螺旋体核酸检测结果阳性，否则为阴性。 10 废弃物处理 检验过程中的废弃物，收集后进行高压蒸汽灭菌处理或其他等效的处理方法。 4 DB22/T 1673—2012 AA 附 录 A （规范性附录） 试剂配制 A.1 10% SDS 在 900 ml 水中溶解 100 g 电泳级 SDS，加热至 68 ℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的 pH 值至 7.2， 加水定容至 1 L，分装备用。 A.2 20 mg/ml蛋白酶K 将200 mg的蛋白酶K加入到9.5 ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定 容到10 ml，然后分装成小份贮存于-20 ℃。 A.3 CTAB/ NaCl溶液 在80 mL水中溶解4.1 gNaCl，缓慢加入10 g CTAB，同时加热并搅拌，如果需要，可加热至65 ℃使 其溶解，定容终体积至100 mL。 A.4 10×TE缓冲液(pH 8.0) 量取1 mol/L Tris-HCl(pH 8.0) 25 mL,0.5 mol/L EDTA(pH 8.0) 1mL ,置于100 mL烧杯中。向烧 杯中加入约40 mL的去离子水，混合均匀，定容至50 mL后，高压灭菌备用。 A.5 0.5 mol/L EDTA 在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2•2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用 NaOH调节溶液的pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒）然后定容至1 L，分装后高压灭菌备用。 _________________________________ 5