ICS 65.120 B 46 备案号：35988-2013 吉 DB22 林 省 地 方 标 准 DB 22/T 1697—2012 饲料中硝呋烯腙的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of Nitrofurfuryl olefinic hydrazone in feed—— Liquid chromatography with tandem-mass spectrometric method 2012 - 12 - 21 发布 吉林省质量技术监督局 2013 - 01 - 01 实施 发 布 DB22/T 1697—2012 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009和GB/T 20001.4-2001给出的规则起草。 本标准由吉林省质量技术监督局提出并归口。 本标准起草单位：吉林省产品质量监督检验院。 本标准主要起草人：王庆峰、刘斌、石金娥、邴炜、华蕾、刘桂华、张庆波、郎乐、李滢倩。 I DB22/T 1697—2012 饲料中硝呋烯腙的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1 范围 本标准规定了饲料中硝呋烯腙含量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本标准适用于浓缩饲料、配合饲料、预混料中硝呋烯腙的测定。 本标准方法检出限为2 μg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 原理 试样中的目标化合物用乙腈-二甲基甲酰胺（60+40）溶液提取，经固相萃取柱净化后，液相色谱- 质谱/质谱测定，外标法定量。 4 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 试剂与材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水符合GB/T 6682的一级水。 乙腈：色谱纯。 甲醇。 二甲基甲酰胺。 硝呋烯腙标准品（CAS 编号: 806-36-4）：纯度≥98%。 乙腈-二甲基甲酰胺（60+40）溶液：取 40 mL 二甲基甲酰胺，加入到 60 mL 乙腈中，混合均匀。 4.6 二甲基甲酰胺-甲醇-水溶液：在 100 mL 容量瓶中加入 2 mL 二甲基甲酰胺和 1 mL 甲醇，用水定容 到刻度。 4.7 5%甲醇水溶液：在 100 mL 容量瓶中加入 5 mL 甲醇，用水稀释到刻度。 4.8 5%二甲基甲酰胺的甲醇溶液，在 100 mL 容量瓶中加入 5 mL 二甲基甲酰胺，用甲醇定容到刻度。 4.9 0.1%甲酸水溶液：于 1000 mL 容量瓶中加入 1 mL 甲酸，用水定容到刻度。 4.10 流动相：0.1%甲酸水溶液 + 乙腈 = 68 + 32 ，取 320 mL 色谱纯乙腈，加入到 680 mL0.1%甲酸 水溶液（4.10）中，混合均匀，过 0.45 μm 有机相微孔滤膜。 4.11 标准储备液（1.0 mg/mL）：准确称取 100.0 mg 硝呋烯腙（4.4），用流动相（4.11）溶解定容 至 100 mL。 4.12 标准工作液系列：取标准储备液（4.12）用流动相（4.11）稀释，配制浓度依次为： 5 μg/L、 10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L。 1 DB22/T 1697—2012 5 仪器和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾（ESI）离子源。 天平：感量 0.0001 g。 离心机：10000 r/min。 超声波水浴。 固相萃取装置。 氮吹仪。 5.7 涡旋混合仪。 5.8 粉碎机。 5.9 试验筛：0.42 mm 孔径。 5.10 固相萃取柱：聚合物固相萃取柱，50 mg/3 mL。 6 试样制备 选取有代表性饲料样品至少500 g，四分法缩减到100 g，粉碎，全部通过0.42 mm试验筛，混匀， 装入密闭容器中，避光保存，备用。 7 分析步骤 7.1 提取 称取2 g试样（精确到0.001 g）于50 mL离心管中，加入10.0 mL乙腈-二甲基甲酰胺（60+40）溶液 （4.6），超声提取15 min，10000 r/min 离心10 min，收集上清液；残渣中加入10.0 mL乙腈-二甲基 甲酰胺（60+40）溶液（4.6）再次提取，合并两次上清液。合并的上清液于45 ℃旋转蒸发至近干，用3 mL二甲基甲酰胺-甲醇-水溶液（4.7）溶解、涡旋混合后作为待净化液。 7.2 净化 固相萃取柱使用前分别用6 mL甲醇和6 mL水进行活化，将待净化液以不超过1 mL/min的速度，过已 活化好的固相萃取柱（4.5），用3 mL5%甲醇水溶液（4.8）淋洗，弃去淋洗液，将固相萃取柱（4.5） 抽干，用5 mL5%二甲基甲酰胺的甲醇溶液（4.9）洗脱，收集洗脱液，用氮气吹干，用流动相（4.11） 定容到1 mL，离心后取上清液，供液相色谱-质谱/质谱测定。 7.3 测定 7.3.1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： a) 色谱柱：C18 填料的液相色谱柱；50 mm×2.1 mm，粒度 1.8 μm，或等效柱； b) 流动相：0.1%甲酸水溶液 + 乙腈 = 68 + 32（4.11）； c) d) e) 进样量：5 μL ； 柱温：30 ℃ ； 流速：0.2 mL/min。 7.3.2 质谱参考条件 2 DB22/T 1697—2012 质谱参考条件如下： a) 离子源：电喷雾（ESI）,负离子模式； b) 离子喷雾电压：4 kV； c) 雾化气：氮气，40 psi； d) 干燥气：氮气，流速：10 mL/min,温度：330 ℃ e) 扫描方式：多反应检测（MRM）; f) 监测离子：母离子 m/z 361.0，定量子离子 m/z 221.9，定性子离子 m/z 196.9； g) 驻留时间：0.3 s； h) 脱溶剂气、锥孔气为氮气，碰撞气为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到 检测要求；锥孔电压、碰撞能量等电压值应优化至最优灵敏度。 7.3.3 空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 7.3.4 液相色谱-质谱/质谱测定 7.3.4.1 定性测定 按照液相色谱-质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，检测目标化合物依据保留时间和两对离子 （特征离子对/定量离子对）所对应的LC-MS/MS色谱峰面积相对丰度进行定性。要求被测试样中目标化 合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20%），同时要求被 测试样中目标化合物的两对离子对应LC-MS/MS色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。相 对丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在硝呋烯腙。 表1 定性离子对相对丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 ＞50％ ＞20％至 50％ ＞10％至 20％ ≤10％ 允许的相对偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％ 7.3.4.2 定量测定 以标准溶液浓度对定量离子峰面积绘制标准曲线，待测样液中硝呋烯腙的响应值应在标准曲线线性 范围内，超过线性范围则应用流动相稀释后再进行分析，外标法定量。 8 结果计算 测定结果可由仪器工作站自动计算，或按公式（1）计算 X = C ´V ........................................(1) m 式中： X ——样品中硝呋烯腙的总量，单位为微克每千克（μg/kg）； C ——由标准曲线计算得试液中硝呋烯腙的浓度，单位为微克每升（μg/L）； V ——样品定容体积，毫升（mL）； m ——样品取样质量，克（g）。 计算结果保留两位有效数字。 3 DB22/T 1697—2012 9 回收率和精密度 9.1 回收率 本方法在5 μg/kg-20 μg/kg浓度范围内,用空白阴性样品添加标准溶液进行校正,其回收率范围为 70%-110%。 9.2 精密度 9.2.1 重复性 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。 9.2.2 再现性 在再现性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。 4 DB22/T 1697—2012 AA 附 录 A （资料性附录） 饲料中硝呋烯腙测定的相关色谱图和质谱图 图A.1 基质匹配加标硝呋烯腙的样品 MRM 色谱图（硝呋烯腙添加浓度为 20 μg/kg） 图A.2 硝呋烯腙 MRM 质谱图（硝呋烯腙添加浓度为 20 μg/kg） _____________________ 5