ICS 11.220 B 41 DB34 安 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 1943—2013 猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测套式 RT-PCR 方法 Method of detection and differentiation of virulent and vaccine strains of classical swine fever virus by nested RT-PCR 2013 - 08 - 28 发布 安徽省质量技术监督局 2013 - 09 - 28 实施 发 布 DB34/T 1943—2013 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽安泰农业开发有限责任公司、安徽 浩翔农牧有限公司、蚌埠市八大集种猪场提出。 本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：安徽农业大学、安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽安泰农业开发有限责任公 司、安徽浩翔农牧有限公司、蚌埠市八大集种猪场。 本标准主要起草人：孙裴、李郁、魏建忠、朱良强、殷宗俊、杨勇、何长生、高亚飞、占松鹤、曾 祥明、秦娟。 I DB34/T 1943—2013 猪瘟病毒强毒株与疫苗株鉴别检测套式 RT-PCR 方法 1 范围 本标准规定了猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）野毒株与疫苗株鉴别检测的套式 RT-PCR方法。 本标准适用于猪瘟的诊断和监测，适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核酸 的检测及野毒株与疫苗免疫毒株的鉴别。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 27540 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 强毒株 能使猪产生临床症状和死亡的猪瘟病毒株称猪瘟病毒强毒株。 3.2 疫苗株 能够引起机体免疫应答，但不能或轻微能使猪产生临床症状的猪瘟病毒株称猪瘟病毒疫苗株。 4 试剂和材料 4.1 试剂 除另有说明，所有试剂均为分析纯；所有试剂均用无 RNA 酶的容器分装。 4.2 Trizol RNA 提取试剂，包装瓶用锡箔纸包裹，于 4℃～8℃保存。 氯仿：4℃预冷。 4.3 异丙醇 1 DB34/T 1943—2013 4℃预冷。 4.4 75％乙醇 用新开启的无水乙醇和 DEPC 水配制，-20℃预冷。 4.5 DEPC 水 去离子水中加入 0.1％ DEPC，37℃作用 1 h，（121±2）℃，高压灭菌 15 min。 4.6 RNA 酶抑制剂（30 U/μL）。 4.7 10×PCR buffer（10 mmol/L pH 8.3Tris-HCl，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2）。 4.8 dNTP（2.5 mmol/L）。 4.9 用于 RT-PCR 反应的引物浓度为 10 μmol/L，其序列如下： ——套式第一步上游引物 F1：5- GTAGCAAGACTGGRAAYAGGTA-3, Y=C 或 T, R=A 或 G； ——套式第二步上游引物 F2：5-ACCCTRTTGTARATAACACTA-3，Y=C 或 T, R=A 或 G； ——共用下游引物 R：5-AAAGTGCTGTTAAAAATGAGTG-3。 4.10 反转录酶 Superscript Ⅲ 反转录酶（200 U/μL） 4.11 DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 4.12 阴性对照 DEPC 水。 4.13 阳性对照 中国猪瘟兔化弱毒疫苗（C 株）、标准 Shimen 强毒株。 5 器材和设备 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 6 高速台式冷冻离心机：最大离心力 12 000g 以上。 冰箱 PCR 检测仪 组织匀浆器 微量移液器和吸头 离心管 样品的采集 样品的采集 6.1 采样注意事项 2 DB34/T 1943—2013 采样及样品前处理过程应戴一次性手套，样本不得交叉污染。 6.2 采样工具 扁桃体采样器：鼻捻子、开口器和采样枪。使用前均应用 3％氢氧化钠溶液浸泡消毒 5 min～10 min， 经清水冲洗。 灭菌牙签和 0.5 mL 或 1.5 mL 离心管经（121±2）℃，高压灭菌 15 min；剪刀、镊子经 160℃ 干烤 2 h。 6.3 采样方法 6.3.1 活体样品 固定活猪的上唇，用开口器打开口腔，用采样枪采取扁桃体样品，用灭菌牙签挑至 0.5 mL 或 1.5 mL 离心管并作标记，编号，送实验室。取待检样品，按 1:5 倍体积加入 DEPC 水，于研钵或组织匀浆 器中充分研磨，3 000 g 离心 15 min，取上清液转入离心管中编号备用。 6.3.2 内样样品 采取病死猪各种脏器（淋巴结、脾脏、肝脏、回肠、肾脏）装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编 号，送实验室。取 50 mg～100 mg 待检样品，按 1:5 倍体积加入 DEPC 水，于研钵或组织匀浆器中充 分研磨，3 000 g 离心 15 min，取上清液转入离心管中编号备用。 6.3.3 4％EDTA 抗凝血 用无菌注射器抽取全血，注入含 1/10 4％ EDTA 溶液的无菌容器中，充分混匀后编号备用。 6.3.4 排泄物 挑取少许粪便样本于离心管中，加入适量生理盐水，振荡混匀，室温 3 000 g 离心 15 min，取上 清液转入离心管中编号备用。其余液体排泄物直接转入离心管编号备用。 6.3.5 细胞培养物 细胞培养物冻融 3 次，转入离心管中编号备用。 6.3.6 存放与运送 采集或处理的样品在 2℃～8℃ 条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置 -70℃ 冰箱， 但应避免反复冻融（冻融不超过 3 次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在 6 h～ 8 h 之内运送到实验室。 按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。 7 套式 RT-PCR 检测 7.1 核酸提取 在样本制备区，按照 GB/T 27540 的规定进行。 7.1.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管，其中 n 为待检样品数×重复数 3+阳性管数 2+阴性管数 1，对每 个离心管进行编号。 3 DB34/T 1943—2013 7.1.2 每管加入 500 μL Trizol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 μL（检测过程各管 不得交叉污染），颠倒 10 次混匀，静止 5 min；再加入 200 μL 氯仿，混匀器上振荡混匀 5 s（也可 以用手反复颠倒混匀）。于 4℃、12 000 g 离心 15 min。 7.1.3 取与 7.1.1 中相同数量灭菌的 1.5 mL 离心管，加入 500 μL 异丙醇（4℃预冷），对每个管进 行编号。取 7.1.2 中离心后的上清液约 500μL（注意不要吸出中间层）转移至相应的管中，颠倒混匀， -20℃静置 30 min。 7.1.4 于 4 ℃、12 000 g 离心 15 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于 吸水纸上，沾干液体，加入 600 μL 75％乙醇，颠倒洗涤。 7.1.5 于 4℃、12 000 g 离心 15 min（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于 吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干）。 7.1.6 4 000 g 离心 10 s（离心管开口保持朝离心机转轴方向放置），用微量加样器小心将残余液体 吸干，室温干燥 3 min～10 min。 7.1.7 加入 38 μL 经 DEPC 处理的水和 2 μL RNA 酶抑制剂，轻柔混匀，溶解管壁上的 RNA，冰上保 存备用。提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT-PCR 扩增；若需上期保存应放置 -70℃冰箱。 7.2 cDNA 合成 7.2.1 吸取 5μL 上述 RNA 溶液至 PCR 管中。 7.2.2 加入 1μL 50 pmol/L 的下游引物，68℃作用 5 min，冰水浴中降温（或在 PCR 仪中采用程序： 68℃反应 5 min，置于 4℃结束反应）。 7.2.3 加入下列试剂： ——2 μL 5×第一链缓冲液（first strand buffer） ——0.5 μL 0.1 mol/L DTT ——0.5 μL dNTP（10 mmol/L） ——0.25 μL RNA 酶抑制剂（RNase inhibitor） PCR 仪中 50℃反应 60 min，75℃温浴 10 min，置于 4℃结束反应。 7.3 PCR 7.3.1 吸取上述 cDNA 模版 3 μL，DEPC 水 34.5 μL。 7.3.2 加入下列试剂： ——5 μL 10×PCR 缓冲液 ——3 μL dNTP（10 mmol/L） ——1 μL 上游引物 F1 ——1 μL 下游引物 R ——2.5 μL HS Taq DNA 聚合酶 将混合物吹打均匀后，至 PCR 仪中扩增，条件如下：94℃预热 3 min，94℃变性 40 s，55℃退火 40 s，72℃链延伸 40 s，35 个循环，72℃温育 7 min。置于 4℃结束反应。 7.4 套式 PCR 7.4.1 吸取上述 PCR 模版 1.5μL，DEPC 水 36μL。 7.4.2 加入下列试剂： ——5 μL 10×PCR 缓冲液 ——3 μL dNTP（10 mmol/L） ——1 μL 上游引物 F2 4 DB34/T 1943—2013 ——1 μL 下游引物 R ——2.5 μL HS Taq DNA 聚合酶 将混合物吹打均匀后，至 PCR 仪中扩增，条件如下：94℃预热 3 min，94℃变性 40 s，55℃退火 40 s，72℃链延伸 40 s，35 个循环，72℃温育 7 min。置于 4℃结束反应。 7.5 电泳 取 6 μL～10 μL PCR 产物在 4％琼脂糖凝胶中进行电泳，缓冲液为 0.5×TBE，100 V、40 min。 7.6 凝胶成像及结果判定 阳性样品（中国猪瘟兔化弱毒疫苗 C 株）出现 149 bp 大小条带、阳性样品（标准强毒 Shimen 毒株）出现 135 bp 大小条带、阴性样品无条带出现时，试验成立。被检测样品出现 149 bp 大小条带 为猪瘟疫苗株，出现 135 bp