中华人民共和国国家标准 GB 5009.139 —2014 2014-12-01发布 2015-05-01实施 食品安全国家标准 饮料中咖啡因的测定 GB 5009.139 —2014 I 前 言 本标准代替 GB/T 5009.139 -2003《饮料中咖啡因的测定》， GB/T19182 -2003《咖啡 咖啡因含量的 测定 -液相色谱法》 。 本标准与 GB/T 5009.139 -2003相比，主要变化如下： ——删除原标准 GB/T 5009.139 -2003中第一法 紫外分光光度法； ——增加样品分类； ——修改样品处理条件； ——修改检出限，增加定量限； ——修改色谱条件 。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： —— GB/T 5009.139 -2003； —— GB/T 19182 -2003。 GB 5009.139 —2014 1 食品安全国家标准 饮料中咖啡因的测定 1 范围 本标准规定了 可乐型饮料，咖啡、茶叶及其固体和液体饮料制品中咖啡因含量的测定方法 —高效 液相色谱法 。 本标准适用于 可乐型饮料，咖啡、茶叶及其固体和液体饮料制品中咖啡因含量的测定 。 2 原理 可乐型饮料脱气后，用水提取、氧化镁净化；不含乳的咖啡及茶叶液体饮料制品用水提取、氧化 镁净化；含乳的咖啡及茶叶液体饮料制品经三氯乙酸溶液沉降蛋白；咖啡、茶叶及其固体饮料制品用 水提取、氧化镁净化；然后经 C18色谱柱分离，用 紫外检测器检测，外标法定量 。 3 试剂和材 料 注：除非另有说明， 本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 3.1 试剂 3.1.1 氧化镁（ MgO）。 3.1.2 三氯乙酸 (CCl 3COOH)。 3.1.3 甲醇（ CH 3OH）：色谱纯 。 3.2 试剂配制 三氯乙酸溶液（ 10 g/L）：称取 1g三氯乙酸（ 3.1.2）于 100 mL容量瓶中，用水定容至刻度 。 3.3 标准品 咖啡因标准品（ C8H10N4O2）：纯度≥99%。 3.4 标准溶液配制 3.4.1 咖啡因标准储备液（ 2.0 mg/mL）：准确称取咖啡 因标准品 20 mg（精确至 0.1 mg）于 10 mL容量 瓶中，用甲醇溶解定容。放置于 4℃冰箱，有效期为六个月。 3.4.2 咖啡因标准中间液（ 200 μg/mL）：准确吸取 5.0 mL咖啡因标准储备液（ 3.4.1）于 50 mL容量瓶 中，用水定容。放置于 4℃冰箱，有效期为一个月 。 3.4.3 咖啡因标准曲线工作液：分别吸取咖啡因标准中间液（ 3.4.2）0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、 10.0 mL至10 mL容量瓶中，用水定容。该标准系列浓度分别为 10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、40.0 μg/mL、 100 μg/mL、200 μg/mL。临用时配制。 GB 5009.139 —2014 2 4 仪器和设备 4.1 高效液相色谱仪，带紫外检测器或二极管阵列检测器。 4.2 天平：感量为 0.1 mg。 4.3 水浴锅。 4.4 超声波清洗器。 4.5 0.45 μm微孔水相滤膜。 5 分析步骤 5.1 试样制备 5.1.1可乐型饮料 ： a) 脱气：样 品用超声清洗器在 40℃下超声 5 min； b) 净化：称 取5 g（精确至 0.001 g）样品，加水定容至 5 mL（使样品溶液中咖啡因含量 在标准曲 线范围内），摇匀，加入 0.5g氧化镁，振摇，静置，取上清液经微孔滤膜过滤，备用。 5.1.2 不含乳的 咖啡及茶叶液体制品： 称取5 g（精确至 0.001 g）样品，加水定容至 5 mL（使样品溶液 中咖啡因含量在标准曲线范围内），摇匀， 加入 0.5g氧化镁，振摇，静置，取上清液经微孔滤膜过滤， 备用。 5.1.3 含乳的咖啡及茶叶 液体制品 ：称取 1 g（精确至 0.001g）样品，加入三氯乙酸溶液定容至 10 mL （使样品溶液中咖啡因含量在标准曲线范围内），摇匀，静置，沉降蛋白，取上清液经微孔滤膜过滤， 备用。 5.1.4 咖啡、茶叶及其固体制品： 称取 1 g（精确至 0.001g）经粉碎低于 30目的均匀样品于 250 mL锥形 瓶中，加入约 200 mL水，沸水浴 30 min，不时振摇，取出流水冷却 1 min，加入 5g氧化镁，振摇，再 放入沸水浴 20 min，取出锥形瓶，冷却至室温，转移至 250 mL容量瓶中，加水定容至刻度 （使样品溶 液中咖啡因含量在标准曲线范围内） ，摇匀，静置，取上清液经微孔滤膜过滤，备用。 5.2 仪器参考条件 色谱柱： C18柱（粒径5μm，柱长 150 mm×直径 3.9 mm）或同等性能的色谱柱 。 流动相：甲醇 +水=24+76。 流速： 1.0 mL/min。 检测波长： 272 nm。 柱温： 25℃。 进样量： 10 μL。 5.3 标准曲线的制作 将标准系列工作液分别注入 液相色谱 仪中，测定相应的 峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标 ， 以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线 （咖啡因标准 色谱图见附录 A中图 A.1）。 5.4 试样溶液的测定 将试样溶液注入 液相色谱 仪中，以保留时间定性，同时记录峰面积 ，根据标准曲线得到待测液中 咖啡因的浓度，平行测定次数不少于两次。 6 分析结果的表述