书 书 书中华人民共和国国家标准 犌犅 ５００９ ． ２１１ — ２０２２ 食品安全国家标准 食品中叶酸的测定 ２０２２  ０６  ３０ 发布 ２０２２  １２  ３０ 实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布书 书 书犌犅 ５００９ ． ２１１ — ２０２２ Ⅰ 　　　　前 　　 言 　　 本标准代替 ＧＢ５００９．２１１ — ２０１４ 《 食品安全国家标准 　 食品中叶酸的测定 》。 本标准与 ＧＢ５００９．２１１ — ２０１４ 相比 ， 主要变化如下 ： ——— 增加了微孔板测定方法 ； ——— 修改了精密度要求 ； ——— 修改了附录 Ａ 。犌犅 ５００９ ． ２１１ — ２０２２ １ 　　　　食品安全国家标准 食品中叶酸的测定 １ 　 范围 本标准规定了食品中叶酸的测定方法 。 本标准适用于食品中叶酸的测定 。 ２ 　 原理 叶酸是鼠李糖乳杆菌 （ 犔犪犮狋狅犫犪犮犻犾犾狌狊狉犺犪犿狀狅狊狌狊 ） 生长所必需的营养素 。 在一定控制条件下 ， 将鼠李糖乳杆菌菌液接种至含有试样液的培养基中 ， 培养一段时间后测定透光率 （ 或吸光度值 ）， 在一定测定范围内可以根据叶酸含量与透光率 （ 或吸光度值 ） 的标准曲线计算出试样中叶酸的含量 。 ３ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 本方法所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的二级水 。 ３ ． １ 　 试剂 ３ ． １ ． １ 　 盐酸 （ ＨＣｌ ）。 ３ ． １ ． ２ 　 氢氧化钠 （ ＮａＯＨ ）。 ３ ． １ ． ３ 　 氯化钠 （ ＮａＣｌ ）。 ３ ． １ ． ４ 　 十二水合磷酸钠 （ Ｎａ ３ ＰＯ ４ · １２Ｈ ２ Ｏ ）。 ３ ． １ ． ５ 　 七水合磷酸氢二钠 （ Ｎａ ２ ＨＰＯ ４ · ７Ｈ ２ Ｏ ）。 ３ ． １ ． ６ 　 Ｌ 抗坏血酸 （ Ｃ ６ Ｈ ８ Ｏ ６ ）。 ３ ． １ ． ７ 　 甲苯 （ Ｃ ７ Ｈ ８ ）。 ３ ． １ ． ８ 　 无水乙醇 （ Ｃ ２ Ｈ ６ Ｏ ）。 ３ ． １ ． ９ 　 鸡胰腺冻干粉 ： 含 γ  谷胺酰基水解酶 。 ３ ． １ ． １０ 　 木瓜蛋白酶 ： 酶活力 ≥ ５Ｕ ／ ｍｇ 。 ３ ． １ ． １１ 　 α  淀粉酶 ： 酶活力 ≥ １．５Ｕ ／ ｍｇ 。 ３ ． ２ 　 试剂配制 ３ ． ２ ． １ 　 磷酸盐缓冲液 （ ０．０５ｍｏｌ ／ Ｌ ， ｐＨ６．８ ）： 分别称取 ４．３５ｇ 十二水合磷酸钠和 １０．３９ｇ 七水合磷酸氢二钠 ， 加水溶解并定容至 １Ｌ ， 混匀 。 加入 ２ｍＬ 甲苯 ， 室温保存 。 临用前按约 ５ｍｇ ／ ｍＬ 的比例加入 Ｌ 抗坏血酸作为叶酸保护剂 ， 调节 ｐＨ 至 ６．８±０．１ 。 ３ ． ２ ． ２ 　 ２０％ 乙醇溶液 （ ２＋８ ）： 量取 ２００ｍＬ 无水乙醇与 ８００ｍＬ 水混匀 。 ３ ． ２ ． ３ 　 氢氧化钠乙醇溶液 （ ０．０１ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ０．４ｇ 氢氧化钠 ， 用 ２０％ 乙醇溶液溶解并定容至 １Ｌ ， 混匀 。 ３ ． ２ ． ４ 　 氢氧化钠溶液 （ １ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ４０ｇ 氢氧化钠 ， 加水溶解并定容至 １Ｌ ， 混匀 。犌犅 ５００９ ． ２１１ — ２０２２ ２ 　　　　 ３ ． ２ ． ５ 　 盐酸浸泡液 ： 量取 １００ｍＬ 盐酸 （ 浓度 ３６％ ～ ３８％ ） 与 ５０ 倍水混合 。 ３ ． ２ ． ６ 　 鸡胰腺溶液 ： 称取 １００ｍｇ 鸡胰腺冻干粉 ， 加入 ２０ｍＬ 磷酸盐缓冲液 ， 摇匀 。 现用现配 。 ３ ． ２ ． ７ 　 蛋白酶  淀粉酶液 ： 分别称取 ２００ｍｇ 木瓜蛋白酶和 α  淀粉酶 ， 加入 ２０ｍＬ 磷酸盐缓冲液研磨至匀浆 ， ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ 。 现用现配 。 ３ ． ３ 　 培养基 ３ ． ３ ． １ 　 菌种储备用琼脂培养基 ： 按 Ａ．１ 配制 。 ３ ． ３ ． ２ 　 叶酸测定培养基 ： 按 Ａ．２ 配制 。 　　 注 ： 以上培养基也可用商品化的合成或成品培养基 ， 用前按说明书配制 。 ３ ． ４ 　 标准品 叶酸标准品 （ Ｃ １９ Ｈ １９ Ｎ ７ Ｏ ６ ， ＣＡＳ ： ５９３０３ ）： 纯度 ≥ ９７％ ， 或经国家认证并授予标准物质证书的标 准品 。 ３ ． ５ 　 标准溶液的配制 ３ ． ５ ． １ 　 叶酸标准储备液 （ ２０．０ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 准确称取 ２０．０ｍｇ 叶酸标准品 ， 用氢氧化钠乙醇溶液溶解 ， 转移并定容至 １０００ｍＬ 棕色容量瓶中 。 将溶液转移至棕色玻璃容器中 ， 于 ２℃ ～ ４℃ 冰箱避光保存 ， 保存期 ２ 年 。 ３ ． ５ ． ２ 　 叶酸标准中间液 （ ０．２００ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 准确吸取 １．００ｍＬ 叶酸标准储备液置于 １００ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用氢氧化钠乙醇溶液稀释并定容至刻度 ， 混匀 。 将溶液转移至棕色玻璃容器中 ， 于 ２℃ ～ ４℃ 冰箱避光保存 ， 保存期 １ 年 。 ３ ． ５ ． ３ 　 叶酸标准工作液 （ ０．２００ｎｇ ／ ｍＬ ）： 准确吸取 １．００ｍＬ 叶酸标准中间液置于 １０００ｍＬ 容量瓶中 ， 用水稀释并定容至刻度 ， 混匀 。 现用现配 。 ４ 　 仪器和设备 ４ ． １ 　 天平 ： 感量为 ０．１ｍｇ 和 １ｍｇ 。 ４ ． ２ 　 恒温培养箱 ： ３６℃±１℃ 。 ４ ． ３ 　 高压灭菌锅 。 ４ ． ４ 　 涡旋振荡器 。 ４ ． ５ 　 离心机 ： ３０００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ４ ． ６ 　 接种环和接种针 。 ４ ． ７ 　 ｐＨ 计 ： 精度为 ±０．１ 。 ４ ． ８ 　 组织粉碎机和研磨仪 。 ４ ． ９ 　 紫外  可见分光光度计 。 ４ ． １０ 　 超净工作台 。 ４ ． １１ 　 超声波振荡器 。 ４ ． １２ 　 酶标仪 。 ４ ． １３ 　 离心管 。 ４ ． １４ 　 微孔板 （ 无菌 ）。 ４ ． １５ 　 滤膜 （ ０．２２ μ ｍ ）。 ４ ． １６ 　 容量瓶 。 　　 注 ： 所用玻璃器具使用前用盐酸浸泡液或月桂基磺酸钠洗涤剂清洗干净后 ， ２５０℃ 干热 １ｈ ～ ２ｈ 。