书 书 书中华人民共和国国家标准 犌犅 ５００９ ． ２４８ — ２０１６ 食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定 ２０１６  ０８  ３１ 发布 ２０１７  ０３  ０１ 实施 中华人民共和国 国家卫生和计划生育委员会 发布书 书 书５００９ ． ２４８ — ２０１６ Ⅰ 　　　　前 　　 言 　　 本标准代替 ＧＢ ／ Ｔ２３２０９ — ２００８ 《 奶粉中叶黄素的测定 　 液相色谱  紫外检测法 》。 本标准与 ＧＢ ／ Ｔ２３２０９ — ２００８ 相比 ， 主要变化如下 ： ——— 标准名称修改为 “ 食品安全国家标准 　 食品中叶黄素的测定 ”； ——— 扩大适用范围 ， 增加在冷冻饮品 、 米面制品 、 焙烤食品 、 果酱 、 果冻和饮料中叶黄素的液相色谱测定方法 ； ——— 对原标准的原理进行了修改 ， 把原用丙酮为溶剂提取改为用乙醚  正己烷  环已烷溶剂体系进行提取 ； ——— 增加操作过程的注意点 ； ——— 增加了对包括奶粉在内的脂肪含量高的样品的皂化步骤 ， 并提供了不同前处理方法以适应各种样品基质分析需要 ； ——— 增加了对叶黄素标准溶液浓度的校正要求 ； ——— 对于在试验操作过程中叶黄素可能产生异构化的现象 ， 增加了对因异构化生成的顺式叶黄素的定性与定量要求 。５００９ ． ２４８ — ２０１６ １ 　　　　食品安全国家标准 食品中叶黄素的测定 １ 　 范围 本标准规定了食品中叶黄素的液相色谱测定方法 。 本标准适用于婴幼儿配方奶粉 、 乳品 、 冷冻饮品 、 米面制品 、 焙烤食品 、 果酱 、 果冻和饮料中叶黄素的 液相色谱测定 。 ２ 　 原理 脂肪含量高 （ 脂肪含量以干基计不低于 ３％ ） 的食品经氢氧化钾溶液室温皂化使叶黄素游离后 ， 再 以乙醚  正己烷  环己烷 （ ４０＋４０＋２０ ， 体积比 ） 提取 ， 液相色谱法分离 ， 紫外检测器或二极管阵列检测器 检测 ， 外标法定量 。 其他食品直接以乙醚  正己烷  环己烷 （ ４０＋４０＋２０ ， 体积比 ） 提取样品中叶黄素 。 提取液经中性氧 化铝固相萃取小柱净化后 ， 液相色谱法分离 ， 紫外检测器或二极管阵列检测器检测 ， 外标法定量 。 样品在提取与分析过程中 ， 反式结构的叶黄素可能发生异构化 ， 转化为顺式叶黄素 。 对于转化产生 的顺式叶黄素 ， 可通过保留时间定性 、 峰面积加合定量 。 ３ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 本方法所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ３ ． １ 　 试剂 ３ ． １ ． １ 　 环己烷 （ Ｃ ６ Ｈ １２ ）： 色谱纯 。 ３ ． １ ． ２ 　 乙醚 ［（ Ｃ ２ Ｈ ５ ） ２ Ｏ ］： 色谱纯 。 ３ ． １ ． ３ 　 正己烷 （ Ｃ ６ Ｈ １４ ）： 色谱纯 。 ３ ． １ ． ４ 　 无水乙醇 （ Ｃ ２ Ｈ ５ ＯＨ ）： 色谱纯 。 ３ ． １ ． ５ 　 甲基叔丁基醚 ［ ＣＨ ３ ＯＣＣ （ ＣＨ ３ ） ３ ， ＭＴＢＥ ］： 色谱纯 。 ３ ． １ ． ６ 　 二丁基羟基甲苯 （ Ｃ １５ Ｈ ２４ Ｏ ， ＢＨＴ ）。 ３ ． １ ． ７ 　 氢氧化钾 （ ＫＯＨ ）。 ３ ． １ ． ８ 　 碘 （ Ｉ ２ ）。 ３ ． ２ 　 试剂配制 ３ ． ２ ． １ 　 １０％ 氢氧化钾溶液 ： 称取 １０ｇ 氢氧化钾 （ ３．１．７ ）， 加水溶解稀释至 １００ｍＬ 。 ３ ． ２ ． ２ 　 ２０％ 氢氧化钾溶液 ： 称取 ２０ｇ 氢氧化钾 （ ３．１．７ ）， 加水溶解稀释至 １００ｍＬ 。 ３ ． ２ ． ３ 　 萃取溶剂 ： 称取 １ｇＢＨＴ （ ３．１．６ ）， 以 ２００ｍＬ 环己烷 （ ３．１．１ ） 溶解 ， 加入 ４００ｍＬ 乙醚 （ ３．１．２ ） 和 ４００ｍＬ 正己烷 （ ３．１．３ ）， 混匀 。 ３ ． ２ ． ４ 　 ０．１％ＢＨＴ 乙醇溶液 ： 称取 ０．１ｇＢＨＴ （ ３．１．６ ）， 以 １００ｍＬ 乙醇 （ ３．１．４ ） 溶解 ， 混匀 。 ３ ． ２ ． ５ 　 碘的乙醇溶液 ： 称取 １ｍｇ 碘 （ ３．１．８ ）， 加乙醇 （ ３．１．４ ） 溶解稀释至 １Ｌ 。５００９ ． ２４８ — ２０１６ ２ 　　　　 ３ ． ３ 　 标准品 叶黄素 （ ＣＡＳ 号 ： １２７４０２ ）， 纯度不低于 ９８．０％ 。 ３ ． ４ 　 标准溶液配制 ３ ． ４ ． １ 　 标准储备液 （ ５０ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 准确称取 ５ｍｇ （ 精确至 ０．０１ｍｇ ） 叶黄素 （ ３．１．３ ）， 以 ０．１％ＢＨＴ 乙醇溶 液 （ ３．２．４ ） 溶解并定容至 １００ｍＬ 。 该标准储备液充氮避光置于 －２０℃ 或以下的冰箱中可保存六个月 。 注 ： 叶黄素标准储备液使用前需校正 ， 具体操作见附录 Ａ 。 ３ ． ４ ． ２ 　 标准工作液 ： 从叶黄素标准贮备液 （ ３．４．１ ） 中准确移取 ０．０５０ｍＬ 、 ０．１００ｍＬ 、 ０．２００ｍＬ 、 ０．４００ｍＬ 、 １．００ｍＬ 溶液入 ５ 个 ２５ｍＬ 棕色容量瓶中 ， 用 ０．１％ＢＨＴ 乙醇溶液 （ ３．２．４ ） 定容至刻度 ， 得到浓度为 ０．１００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．２００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．４００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ０．８００ μ ｇ ／ ｍＬ 、 ２．００ μ ｇ ／ ｍＬ 的系列标准工作液 。 标准工作 液充氮避光置于 －２０℃ 或以下的冰箱中可保存一个月 。 ３ ． ５ 　 中性氧化铝固相萃取小柱 ， ５００ｍｇ ／ ３ｍＬ ， 使用前以 ５ｍＬ 萃取溶剂 （ ３．２．３ ） 淋洗 ， 保持柱体湿润 。 ３ ． ６ 　 ０．４５ μ ｍ 滤膜 ， 有机系 。 ４ 　 仪器和设备 ４ ． １ 　 液相色谱仪 ， 带二极管阵列检测器或紫外检测器 。 ４ ． ２ 　 紫外可见分光光度计 。 ４ ． ３ 　 分析天平 ： 感量 ０．０１ｍｇ 和 ０．０１ｇ 。 ４ ． ４ 　 组织捣碎机 。 ４ ． ５ 　 旋涡振荡器 。 ４ ． ６ 　 振荡器 。 ４ ． ７ 　 减压浓缩装置 。 ４ ． ８ 　 固相萃取装置 。 ４ ． ９ 　 离心机 ： 转速不低于 ４５００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ 　 分析步骤 注 ： 由于叶黄素对光敏感 ， 除非另行说明 ， 所有试验操作应在无 ５００ｎｍ 以下紫外光的黄色光源或红色光源环境中 进行 。 ５ ． １ 　 试样制备 将一定数量的样品按要求经过粉碎 、 均质 、 缩分后 ， 储存于样品瓶中 。 制备好的试样应充氮密封后 置于 －２０℃ 或以下的冰箱中保存 。 ５ ． ２ 　 提取 ５ ． ２ ． １ 　 脂肪含量高的食品 （ 如婴幼儿配方奶粉 、 乳粉 、 冰淇淋 、 焙烤坚果类食品等 ） 准确称取 ２ｇ （ 精确至 ０．０１ｇ ） 均匀试样于 ５０ｍＬ 聚丙烯离心管中 ， 加入约 ０．２ｇＢＨＴ （ ３．１．６ ） 和 １０ｍＬ 乙醇 （ ３．１．４ ）， 混匀 ， 加入 １０ｍＬ１０％ 氢氧化钾溶液 （ ３．２．１ ）， 涡旋振荡 １ｍｉｎ 混匀 ， 室温避光振荡 皂化 ３０ｍｉｎ ， 以 １０ｍＬ 萃取溶剂 （ ３．２．３ ） 避光涡旋振荡提取 ３ｍｉｎ ， ４５００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ ， 重复提取 ２ 次 ， 合并提取液 ， 以 １０ｍＬ 水洗涤 ， ４５００ｒ ／ ｍｉｎ 离心 ３ｍｉｎ 分层 ， 重复洗涤 １ 次 ， 合并有机相于室温减 压浓缩至近干 ， 以 ０．１％ＢＨＴ 乙醇溶液 （ ３．２．４ ） 涡旋振荡溶解残渣并定容至 ５ｍＬ ， 过 ０．４５ μ ｍ 滤膜