中华人民共和国国家标准 GB5009.255—2016 食品安全国家标准 食品中果聚糖的测定 2016-08-31发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 国家卫生和计划生育委员会发布GB5009.255—2016 1 食品安全国家标准 食品中果聚糖的测定 1 范围 本标准规定了食品中果聚糖含量的离子色谱法测定方法。 本标准适用于乳及乳制品、婴幼儿配方食品、婴幼儿谷类辅助食品、固体饮料、配制酒中单独添加的 低聚果糖、多聚果糖或菊粉含量的测定。 2 原理 试样经热水浸提,样液中的蔗糖经蔗糖酶水解成葡萄糖和果糖,葡萄糖和果糖经硼氢化钠还原成相 应的糖醇,多余的硼氢化钠用乙酸中和。样液中的果聚糖经过果聚糖酶水解成果糖和葡萄糖,经离子色 谱-脉冲安培检测器测定果糖含量,通过换算系数,折算得到果聚糖的含量。 3 试剂和材料 3.1 试剂 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 3.1.1 氢氧化钠(NaOH)。 3.1.2 马来酸(C4H4O4)。 3.1.3 蔗糖酶:来源于酵母,酶活力≥300U。 3.1.4 硼氢化钠(NaBH4)。 3.1.5 冰乙酸(CH3COOH)。 3.1.6 三水乙酸钠(CH3COONa·3H2O)。 3.1.7 果聚糖酶:来源于黑曲霉,酶活力≥10000U。 3.1.8 50%氢氧化钠溶液(NaOH):色谱纯。 3.1.9 无水乙酸钠(CH3COONa):纯度≥99.0%。 3.1.10 氮气(N2):纯度≥99.9%。 3.2 试剂配制 3.2.1 氢氧化钠溶液(1mol/L):称取40g氢氧化钠(精确至0.01g),溶于水并稀释至1000mL,室温 下可放置2个月。 3.2.2 马来酸钠缓冲溶液(100mmol/L,pH6.5):称取1.16g马来酸(精确至0.01g)于150mL烧杯 中,加入约70mL水溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH6.5,用水稀释至100mL。4℃保存,可放 置3个月。 3.2.3 蔗糖酶溶液(4.5U/mL):将蔗糖酶(活力为300U)溶解于66mL马来酸钠缓冲溶液,分装到 2mL的离心管中,-20℃保存,可放置6个月。使用前需测定酶活力。 3.2.4 氢氧化钠溶液(50mmol/L):称取2g氢氧化钠(精确至0.01g),溶于水并稀释至1000mL,室GB5009.255—2016 2 温下可放置2个月。 3.2.5 硼氢化钠溶液(10mg/mL):准确称取适量硼氢化钠(精确至0.001g)于聚丙烯离心管中,用 50mmol/L氢氧化钠溶液溶解,最终质量浓度为10mg/mL,用时现配。 3.2.6 乙酸溶液(200mmol/L):吸取0.6mL冰乙酸,用水稀释至50mL,4℃保存,可放置2个月。 3.2.7 乙酸钠溶液(200mmol/L):称取1.36g三水乙酸钠(精确至0.01g),溶于水并稀释至50mL, 4℃保存,可放置2个月。 3.2.8 乙酸钠缓冲溶液(pH4.5):吸取14mL乙酸溶液和11mL乙酸钠溶液混合,并用水稀释至 50mL,用时现配。 3.2.9 果聚糖酶溶液(455U/mL):将果聚糖酶(活力为10000U)溶解于22mL乙酸钠缓冲溶液,分装 到2mL的离心管中,-20℃保存,可放置6个月。使用前需测定酶活力。 3.2.10 氢氧化钠溶液(200mmol/L):取10.4mL50%氢氧化钠溶液,用水稀释至1000mL,通入氮气 保护,缓慢摇匀,室温下可放置7d。 3.2.11 氢氧化钠(150mmol/L)乙酸钠(500mmol/L)混合溶液:称取41g无水乙酸钠(精确至 0.01g),用约500mL水溶解,0.22μm滤膜过滤,脱气10min,加入7.8mL50%氢氧化钠溶液,并用水 稀释至1000mL,通入氮气保护,缓慢摇匀,室温下可放置7d。 3.3 标准物质 果糖标准物质(C6H12O6):纯度≥99.0%。 3.4 标准溶液的配制 3.4.1 果糖贮备溶液(2000mg/L):准确称取0.05g(精确至0.1mg)80℃烘干至恒重的果糖标准物质 于50mL烧杯中,加入约10mL热水,待果糖溶解后,冷却至室温,用水稀释至25mL容量瓶中,摇匀, 4℃保存,可放置1个月。 3.4.2 果糖中间溶液(80.0mg/L):吸取果糖贮备溶液1mL,用水稀释至25mL容量瓶中,用时现配。 3.4.3 果糖标准曲线工作溶液:取适量果糖中间溶液,用水配制成质量浓度为0.800mg/L、1.60mg/L、 4.00mg/L、8.00mg/L、16.0mg/L的标准曲线工作溶液。 3.5 材料 3.5.1 净化柱:反相固相萃取柱,填料为苯乙烯二乙烯基苯,2.5mL。 3.5.2 微孔滤膜:水相,0.22μm。 4 仪器和设备 4.1 离子色谱仪:配有三元及以上梯度泵,脉冲安培检测器,Au工作电极。 4.2 天平:感量为0.1mg、0.001g和0.01g。 4.3 pH计:精度为0.01pH。 4.4 旋涡振荡器。 4.5 恒温水浴摇床:控温精度±1℃。 4.6 离心机:转速≥3000r/min。GB5009.255—2016 3 5 分析步骤 5.1 试样制备 5.1.1 试样预处理 5.1.1.1 固体样品:用“四分法”缩分至约200g样品经粉碎机粉碎,混匀,备用。 5.1.1.2 液体样品:将试样装入能够容纳2倍试样体积的带盖容器中,摇匀,备用。 5.1.2 提取 准确称取1g~5g(精确至0.001g,至少含有果聚糖5mg)试样于150mL锥形瓶中,加入80℃± 1℃热水约50mL,置于80℃±1℃恒温水浴摇床中,150r/min振摇15min后,取出,冷却至室温,转 移至100mL容量瓶中,用水分三次冲洗锥形瓶,定容,摇匀,溶液经滤纸过滤或者离心,滤液或上清液 依据标准曲线的线性范围确定稀释倍数,备用。 取上述备用样液200μL于10mL具塞玻璃试管中,估算样液中可能的蔗糖含量,按照每毫克蔗糖 加入300μL蔗糖酶溶液,旋涡振荡混匀,置于40℃±1℃恒温水浴摇床中,150r/min振摇60min后, 加入300μL硼氢化钠溶液,旋涡振荡混匀,置于40℃±1℃恒温水浴摇床中,150r/min振摇30min 后,取出,冷却至室温。加入750μL乙酸溶液,静置10min。估算样液中可能的果聚糖含量,按照每毫 克果聚糖加入1.2mL果聚糖酶溶液,旋涡振荡混匀,置于40℃±1℃恒温水浴摇床中,150r/min振摇 30min后,取出,冷却至室温。转移至10mL容量瓶中,用水分三次冲洗玻璃试管,定容,摇匀。 活化净化柱,试样溶液依次通过0.22μm水相滤膜和净化柱,弃去前面3倍柱体积洗脱液,收集后 面洗脱液待测。同时做试剂空白试验。 5.2 仪器参考条件 5.2.1 仪器参考条件1 5.2.1.1 色谱柱:可兼容梯度洗脱的高容量阴离子交换色谱柱。 5.2.1.2 淋洗液:A:水;B:氢氧化钠溶液(200mmol/L);C:氢氧化钠(150mmol/L)乙酸钠(500mmol/L) 混合溶液。梯度洗脱条件见表1。 表1 梯度洗脱条件 时间 min流速 mL/min淋洗液 % A B C曲线 0~20 1.0 80 20 0 线性 20.1~30 1.0 0 0 100 线性 30.1~40 1.0 0 100 0 线性 40.1~50 1.0 80 20 0 线性 5.2.1.3 检测器:脉冲安培检测器,Au工作电极,Ag/AgCl参比电极,检测池温度30℃,果糖检测波形 参见表2。