中华人民共和国国家标准 GB5009.259—2016 食品安全国家标准 食品中生物素的测定 2016-08-31发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 国家卫生和计划生育委员会发布GB5009.259—2016 Ⅰ 前 言 本标准代替GB5413.19—2010《婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定》。 本标准与GB5413.19—2010相比,主要变化如下: ———标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中生物素的测定”; ———修改了标准曲线管和待测液管制备的表述方式; ———修改了测定步骤表达方式; ———增加了谷薯类、肉类、新鲜果蔬、藻类试样、蛋类、豆类、坚果类、内脏、强化生物素的食品处理 过程; ———删除了仪器和设备中通用玻璃器皿的描述。GB5009.259—2016 1 食品安全国家标准 食品中生物素的测定 1 范围 本标准规定了食品中生物素的测定方法。 本标准适用于食品中生物素的测定。 2 原理 生物素是植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)生长所必需的营养素。在生物素测定培养基中, 植物乳杆菌的生长与待测试样中生物素含量呈线性关系,根据透光率与标准工作曲线进行比较,即可计 算出试样中待测物质的含量。 3 试剂和材料 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的二级水。 3.1 试剂 3.1.1 无水乙醇(C2H6O)。 3.1.2 氢氧化钠(NaOH)。 3.1.3 盐酸(HCl)。 3.1.4 柠檬酸盐。 3.1.5 α-淀粉酶:≥1.5U/mg。 3.1.6 木瓜蛋白酶:≥5U/mg。 3.1.7 硫酸(H2SO4)。 3.2 试剂配制 3.2.1 乙醇溶液(50%):量取500mL无水乙醇与500mL水混匀。 3.2.2 氢氧化钠溶液(0.5mol/L):称取20g氢氧化钠,溶于1000mL水中,混匀。 3.2.3 氯化钠溶液(0.85%):称取8.5g氯化钠,加水溶解并稀释至1000mL,混匀。 3.2.4 盐酸溶液(1mol/L):吸取83mL盐酸,用水稀释至1000mL,混匀。 3.2.5 柠檬酸盐缓冲液(pH4.5):称取1.5g柠檬酸至一个100mL带磁力搅拌器的烧杯中,加入约 50mL蒸馏水至溶解,再加入12mL的NaOH(1mol/L),调节pH至4.5(用0.1mol/LHCl),将溶液 转入100mL容量瓶中,并用蒸馏水定容。该缓冲液可在2℃~8℃储存3d。 3.2.6 蛋白酶-淀粉酶液:分别称取200mg木瓜蛋白酶和α-淀粉酶,加入20mL水研磨至匀浆, 3000r/min离心5min~10min。现用现配。 3.2.7 硫酸溶液(3%):量取30mL硫酸加入到1000mL水混匀。GB5009.259—2016 2 3.3 标准品 生物素(d-Biotin或VitaminH)标准品(C10H16N2O3S):纯度≥99%。 3.4 标准溶液配制 3.4.1 生物素标准储备液(100μg/mL):精确称取100mg生物素标准品,用乙醇溶液(50%)溶解并转 移至1000mL容量瓶中,定容至刻度。储存于棕色瓶中,于2℃~4℃冰箱保存12个月。 3.4.2 生物素标准中间液(1.0μg/mL):准确吸取1.00mL生物素标准储备液置于100mL棕色容量瓶 中,用乙醇溶液(50%)稀释并定容至刻度,混匀后储存于瓶中2℃~4℃冰箱保存6个月。 3.4.3 生物素标准工作液(10ng/mL):准确吸取1.00mL生物素标准中间液置于100mL容量瓶中, 用水稀释定容至刻度,混匀。临用前现配。 3.4.4 标准使用工作液(10ng/mL):分两个浓度,高浓度溶液的浓度为0.2ng/mL;低浓度溶液的浓度 为0.1ng/mL。从工作液中吸取两次各5mL,用水分别定容到250mL和500mL。 3.5 培养基 3.5.1 乳酸杆菌琼脂培养基:可按附录A配制。 3.5.2 乳酸杆菌肉汤培养基:可按附录A配制。 3.5.3 生物素测定用培养基:可按附录A配制。 注:一些商品化合成培养基效果良好,商品化合成培养基按标签说明进行配制。 4 仪器和设备 4.1 天平:感量0.1mg。 4.2 恒温培养箱:37℃±1℃。 4.3 压力蒸汽消毒器:121℃(0.10mPa~0.12mPa)。 4.4 漩涡振荡器。 4.5 离心机:转速≥2000r/min。 4.6 分液器:0mL~10mL。 4.7 可调式电炉。 4.8 pH计:精度±0.01。 4.9 分光光度计。 4.10 超净工作台。 注:玻璃仪器使用前,用活性剂(月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可)对硬玻璃测定管及其他必要的 玻璃器皿进行清洗,清洗之后200℃干热2h。 5 菌种的制备与保存 5.1 菌种 植物乳杆菌Lactobacillusplantarum(ATCC8014)。 5.2 储备菌种的制备 5.2.1 将菌种植物乳杆菌Lactobacillusplantarum(ATCC8014)转接至乳酸杆菌琼脂培养基中,在