中华人民共和国国家标准 GB5009.284—2021 食品安全国家标准 食品中香兰素、甲基香兰素、 乙基香兰素和香豆素的测定 2021-09-07发布 2022-03-07实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局发布GB5009.284—2021 1 食品安全国家标准 食品中香兰素、甲基香兰素、 乙基香兰素和香豆素的测定 1 范围 本标准规定了食品中香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定方法。 本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、糕点、糖果、乳及乳制品、饮料、小麦粉中香兰素、 甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的测定。 第一法 液相色谱法 2 原理 试样加水混匀后,加入乙腈超声提取,经液相色谱分离,紫外检测器或二极管阵列检测器检测,外标 法定量。 3 试剂和材料 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 3.1 试剂与材料 3.1.1 乙腈(CH3CN):色谱纯。 3.1.2 甲酸(HCOOH):色谱纯。 3.1.3 甲醇(CH3OH):色谱纯。 3.1.4 氯化钠(NaCl)。 3.1.5 浓盐酸(HCl):12mol/L。 3.1.6 微孔滤膜:0.45μm,有机相型。 3.2 试剂配制 3.2.1 0.1%甲酸甲醇溶液:吸取1mL甲酸溶于甲醇并稀释至1000mL,临用现配。 3.2.2 盐酸溶液(1mol/L):吸取8.33mL浓盐酸,溶于水并稀释至100mL,临用现配。 3.2.3 甲醇-水溶液(4+1):将甲醇和水按4∶1(体积比)混合均匀。 3.2.4 0.5%甲酸溶液:吸取5mL甲酸,溶于水并稀释至1000mL,临用现配。 3.3 标准品 3.3.1 香兰素标准品(C8H8O3,CAS号:121-33-5):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的 标准品。GB5009.284—2021 2 3.3.2 甲基香兰素标准品(C9H10O3,CAS号:120-14-9):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证 书的标准品。 3.3.3 乙基香兰素标准品(C9H10O3,CAS号:121-32-4):纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证 书的标准品。 3.3.4 香豆素标准品(C9H6O2,CAS号:91-64-5):纯度≥97%,或经国家认证并授予标准物质证书的 标准品。 3.4 标准溶液配制 3.4.1 标准储备液(1000mg/L):准确称取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素各10mg(精确至 0.1mg),分别置于10mL容量瓶中,用0.1%甲酸甲醇溶液溶解并定容至刻度,混匀。将溶液转移至棕 色玻璃容器内,-18℃下避光保存,保存期8个月。 3.4.2 标准混合中间液(10mg/L):吸取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素的标准储备液 (1000mg/L)各1.00mL,置于100mL容量瓶中,加0.1%甲酸甲醇定容至刻度,混匀。将溶液转移至 棕色玻璃容器中,-18℃下避光保存,保存期3个月。 3.4.3 标准混合系列工作液:分别吸取标准混合中间液(10mg/L)0.2mL、1.0mL、5.0mL,置于10mL 容量瓶中,另分别吸取香兰素、甲基香兰素、乙基香兰素、香豆素的标准储备液(1000mg/L)0.2mL、 0.5mL和1mL,置于10mL容量瓶中,加甲醇-水溶液定容至刻度,混匀。标准混合系列工作液的浓度 分别为0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L,临用现配。 4 仪器和设备 4.1 液相色谱仪:配有二极管阵列或紫外检测器。 4.2 天平:感量分别为0.1mg和0.01g。 4.3 涡旋混合器。 4.4 离心机。 4.5 氮气浓缩装置。 4.6 超声波发生器。 5 分析步骤 5.1 样品前处理 5.1.1 试样制备 液态试样摇匀;基质均匀的半固态试样和粉状试样直接用于5.1.2试样提取;其他试样需匀浆或粉 碎均匀。 5.1.2 试样提取 5.1.2.1 婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品 称取1.00g试样,加入10mL水和480μL盐酸溶液,涡旋振荡1min,加入20mL乙腈,涡旋振荡 1min,超声提取30min后,加入5g氯化钠,涡旋振荡2min,8000r/min离心5min,取上清液至玻璃 试管,40℃氮吹至近干,准确加入1.0mL甲醇-水溶液溶解残渣,过0.45μm微孔滤膜后,待测。GB5009.284—2021 3 5.1.2.2 糕点、糖果、乳及乳制品、饮料 称取1.00g试样,加入5mL水(胶基糖果加入10mL水,50℃水浴溶解),涡旋振荡1min,加入 20mL乙腈,涡旋振荡1min,超声提取30min后,加入5g氯化钠,涡旋振荡2min,8000r/min离心 5min(对于含油脂高的糕点样品,采取冷冻离心,8000r/min),取上清液至玻璃试管,40℃氮吹至近 干,准确加入1.0mL甲醇-水溶液溶解残渣,过0.45μm微孔滤膜后,待测。 5.1.2.3 小麦粉 称取1.00g试样,加入10mL水和240μL盐酸溶液,涡旋振荡1min,加入20mL乙腈,涡旋振荡 1min,超声提取30min后,加入5g氯化钠,涡旋振荡2min,8000r/min离心5min,取上清液至玻璃 试管,40℃氮吹至近干,准确加入1.0mL甲醇-水溶液溶解残渣,过0.45μm微孔滤膜后,待测。 5.2 仪器参考条件 5.2.1 色谱柱:C18柱,250mm×4.6mm(内径),5μm(填料粒径)或相当者。 5.2.2 柱温:30℃。 5.2.3 进样量:10μL。 5.2.4 检测波长:279nm。 5.2.5 流速:1.0mL/min。 5.2.6 流动相 A相:0.5%甲酸溶液; B相:乙腈。 梯度洗脱见表1。 表1 梯度洗脱程序 时间/min A/% B/% 0.0 55 45 5.0 40 60 5.1 10 90 8.0 10 90 9.1 55 45 14.0 55 45 5.3 标准曲线的制作 将标准混合系列工作液分别注入液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以标准系列工作液中香兰素、 甲基香兰素、乙基香兰素和香豆素的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。香兰素、甲基香 兰素、乙基香兰素、香豆素标准溶液的色谱图参见附录A中图A.1。 5.4 试样溶液的测定 将试样溶液注入液相色谱仪中,得到峰面积,根据标准曲线得到试样溶液中被测化合物的浓度。