书 书 书　　 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G29 /G2A 犌犅 ５００９ ． ２８５ — ２０２２ /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G28 /G21 /G22 /G29 /G2A /G2B /G2C 犅 １２ /G2D /G2E /G2F ２０２２  ０６  ３０ /G30 /G31 ２０２２  １２  ３０ /G32 /G33 /G21 /G22 /G23 /G24 /G25 /G26 /G27 /G27 /G28 /G2B /G2C /G2D /G2E /G2F /G30 /G31 /G27 /G28 /G32 /G33 /G34 /G35 /G36 /G37 /G38 /G39 /G30 /G31书 书 书犌犅 ５００９ ． ２８５ — ２０２２ １ 　　　　 前 　　 言 　　 本标准代替 ＧＢ５４１３．１４ — ２０１０ 《 食品安全国家标准 　 婴幼儿食品和乳品中维生素 Ｂ １２ 的测定 》。 本标准与 ＧＢ５４１３．１４ — ２０１０ 相比 ， 主要变化如下 ： ——— 增加了第一法液相色谱法 ； ——— 增加了第二法液相色谱  质谱法 ； ——— 删除了规范性引用文件 ； ——— 修改了原微生物法为第三法 。犌犅 ５００９ ． ２８５ — ２０２２ １ 　　　　 食品安全国家标准 食品中维生素 犅 １２ 的测定 １ 　 范围 本标准规定了食品中维生素 Ｂ １２ 的测定方法 。 第一法液相色谱法适用于婴幼儿食品 、 乳及乳制品 、 肉及肉制品中维生素 Ｂ １２ 的测定 。 第二法液相色谱  质谱法适用于婴幼儿食品 、 乳及乳制品 、 肉及肉制品 、 即食谷物 、 烘焙食品 、 果冻 、 饮料中维生素 Ｂ １２ 的测定 。 第三法微生物法适用于婴幼儿食品 、 乳及乳制品中维生素 Ｂ １２ 的测定 。 第一法 　 液相色谱法 ２ 　 原理 试样经酶解后 ， 用氰化钾 （ 或氰化钠 ） 溶液将钴胺素异构体 （ 羟钴胺素 、 甲钴胺素和 ５ 脱氧腺苷钴胺素等 ） 转化为氰钴胺素 。 样液通过免疫亲和柱净化 、 浓缩后 ， 反相液相色谱柱分离 ， 紫外检测器检测 ， 外标法定量 。 ３ 　 试剂和材料 除非另有说明 ， 所用试剂均为分析纯 ， 水为 ＧＢ ／ Ｔ６６８２ 规定的一级水 。 ３ ． １ 　 试剂 ３ ． １ ． １ 　 无水乙酸钠 （ ＣＨ ３ ＣＯＯＮａ ）。 ３ ． １ ． ２ 　 乙酸 （ ＣＨ ３ ＣＯＯＨ ）。 ３ ． １ ． ３ 　 甲醇 （ ＣＨ ３ ＯＨ ）： 色谱级 。 ３ ． １ ． ４ 　 乙腈 （ ＣＨ ３ ＣＮ ）： 色谱级 。 ３ ． １ ． ５ 　 三氟乙酸 （ ＣＦ ３ ＣＯＯＨ ）： 色谱级 。 ３ ． １ ． ６ 　 氰化钾或氰化钠 （ ＫＣＮ ／ ＮａＣＮ ）。 ３ ． １ ． ７ 　 胃蛋白酶 （ ＣＡＳ 号 ： ９００１７５６ ， 活力 ≥ ４００Ｕ ／ ｍｇ ）。 ３ ． １ ． ８ 　 淀粉酶 （ 活力 ≥ ５０Ｕ ／ ｍｇ ）。 ３ ． １ ． ９ 　 乙醇 （ Ｃ ２ Ｈ ６ Ｏ ）。 ３ ． ２ 　 试剂配制 ３ ． ２ ． １ 　 乙醇溶液 （ ２５％ ）： 量取 ２５０ｍＬ 乙醇 ， 加水稀释至 １０００ｍＬ ， 混匀 。 ３ ． ２ ． ２ 　 乙酸钠缓冲液 （ ０．２５ｍｏｌ ／ Ｌ ）： 称取 ２０．５ｇ 无水乙酸钠 ， 用 ９５０ｍＬ 水溶解并用乙酸调 ｐＨ 至 ４．０±０．１ ， 用水稀释至 １０００ｍＬ 。犌犅 ５００９ ． ２８５ — ２０２２ ２ 　　　　 ３ ． ２ ． ３ 　 氰化钾 （ 或氰化钠 ） 溶液 （ １０ｍｇ ／ ｍＬ ）： 称取 １．０ｇ 氰化钾 （ 或氰化钠 ） 固体 ， 加适量水溶解 ， 并用水稀释至 １００ｍＬ 。 注 ： 氰化钾 （ 或氰化钠 ） 为剧毒化学品 ； 操作者须带防护用具 ， 在通风橱内进行氰化钾 （ 或氰化钠 ） 溶液的配制或 使用 。 ３ ． ２ ． ４ 　 三氟乙酸溶液 （ ０．０４％ ， 体积比 ）： 量取 ５００ｍＬ 水 ， 加入 ２００ μ Ｌ 三氟乙酸 ， 混匀 。 ３ ． ３ 　 标准品 维生素 Ｂ １２ （ 氰钴胺素 ） 标准品 （ Ｃ ６３ Ｈ ８８ ＣｏＮ １４ Ｏ １４ Ｐ ， ＣＡＳ 号 ： ６８１９９ ）： 纯度 ≥ ９９％ ， 或经国家认证并 授予标准物质证书的标准品 。 ３ ． ４ 　 标准溶液配制 ３ ． ４ ． １ 　 维生素 Ｂ １２ 标准储备液 （ １ｍｇ ／ ｍＬ ）： 称取 １０ｍｇ （ 精确至 ０．０１ｍｇ ） 维生素 Ｂ １２ 标准品于 ５０ｍＬ 烧 杯中 ， 用乙醇溶液溶解后 ， 转移至 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙醇溶液定容至刻度 ， 摇匀 ， 转移至棕色试剂瓶 ， 于 －２０℃ 下避光保存 ， 有效期 ６ 个月 。 ３ ． ４ ． ２ 　 维生素 Ｂ １２ 标准工作液 （ １０ μ ｇ ／ ｍＬ ）： 吸取 １．００ｍＬ 维生素 Ｂ １２ 标准储备液 ， 置于 １００ｍＬ 容量瓶中 ， 用乙醇溶液定容至刻度 。 转移至棕色试剂瓶中 ， 于 ４℃ 下避光保存 ， 有效期 １ 个月 。 ３ ． ４ ． ３ 　 维生素 Ｂ １２ 标准系列工作溶液 ： 准确吸取标准工作液 ３０ μ Ｌ 、 ６０ μ Ｌ 、 ９０ μ Ｌ 、 １５０ μ Ｌ 和 ２００ μ Ｌ ， 分别置于 １０ｍＬ 容量瓶中 ， 用水定容至刻度 。 其浓度分别为 ： ３０ｎｇ ／ ｍＬ 、 ６０ｎｇ ／ ｍＬ 、 ９０ｎｇ ／ ｍＬ 、 １５０ｎｇ ／ ｍＬ 和 ２００ｎｇ ／ ｍＬ 。 临用现配 。 ３ ． ５ 　 材料 ３ ． ５ ． １ 　 维生素 Ｂ １２ 免疫亲和柱 ， 柱容量 ≥ ８００ｎｇ ， 柱回收率 ≥ ８５％ （ 验证方法参见附录 Ａ ）。 ３ ． ５ ． ２ 　 玻璃纤维滤纸 。 ３ ． ５ ． ３ 　 微孔滤膜 ： 水相 ， ０．２２ μ ｍ 。 ４ 　 仪器和设备 ４ ． １ 　 液相色谱仪 ： 带紫外检测器 。 ４ ． ２ 　 天平 ： 感量为 ０．０１ｇ 、 ０．００１ｇ 和 ０．００００１ｇ 。 ４ ． ３ 　 ｐＨ 计 ： 精度 ０．０１ 。 ４ ． ４ 　 水浴恒温振荡器 ： 温度范围 ２５℃ ～ １００℃ 。 ４ ． ５ 　 超声波清洗器 。 ４ ． ６ 　 离心机 ： 转速 ≥ １００００ｒ ／ ｍｉｎ 。 ５ 　 分析步骤 注 ： 操作过程应避免紫外光照 ， 并尽可能避光操作 。 ５ ． １ 　 样品前处理 ５ ． １ ． １ 　 试样制备 固体样品粉碎 、 研磨 ， 或用绞肉机制成食糜 ， 均质混匀 。 液体样品试验前振摇混匀 。