中华人民共和国国家标准 GB 5413.14—2010 中华人民共和国卫生部 发布 2010-03-26 发布 2010-06-01 实施食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定 National food safety standard Determination of vitamin B 12 in foods for infant s and young children, milk and milk products GB 5413.14—2010 I 前 言 本标准代替GB/T 5413.14-1997 《婴幼儿食品和乳粉 维生素B 12的测定》。 本标准与GB/T 5413.14-1997 相比，主要变化如下： ——标准名称改为《婴幼儿食品和乳品中维生素B 12的测定》。 本标准附录A 为规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——GB 5413-1985 、GB/T 5413.14-1997 。 GB 5413.14—2010 1 食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定 1 范围 本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定方法。 本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素 B12的测定。 2 规范性引用文件 本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本 适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。 3 原理 利用莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii ）对维生素 B12的特异性和灵敏性，定量测定出 试样中维生素 B12的含量。在测定用培养基中供给除维生素 B12以外的所有营养成分，这样微生物生长 产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中维生素 B12的含量相对应。 以不同浓度标准溶液 的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线，根据标准曲线即可计算出试样中维生素 B12 的含量。 4 试剂和材料 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的二级水。 4.1 菌株：莱士曼氏乳酸杆菌（Lactobacillus leichmannii ）ATCC 7830 。 4.2 维生素 B 12 （Vitamin B 12或Cyanocobalamin ）标准品：分子式 C 63H88CoN 14O14P，纯度≥99% 。 4.3 培养基 4.3.1 乳酸杆菌琼脂培养基：见附录 A。 4.3.2 乳酸杆菌肉汤培养基：见附录 A。 4.3.3 维生素 B12测定用培养基：见附录 A。 注：一些商品化合成培养基效果良好，商品化合成培养基按标签说明进行配制。 4.4 9 g/L氯化钠溶液（生理盐水） 称取 9.0 g氯化钠溶解于 1000 mL 水中，分装于具塞试管，每管 10 mL。121 ℃灭菌 15 min。 4.5 乙醇溶液：体积分数为 25 %。 4.6 无水磷酸氢二钠（Na 2HPO 4）。 4.7 无水偏重亚硫酸钠（Na 2S2O5）。 4.8 柠檬酸（含一个结晶水）（C 6H8O7•H2O）。 4.9 标准溶液的制备 4.9.1 维生素 B12贮备液（ 10 μg /mL）：精确称取维生素 B12标准品（ 4.2），用乙醇溶液（4.5 ）定容 至维生素 B12浓度为 10 μg /mL。 GB 5413.14—2010 2 4.9.2 维生素 B12中间液（100 ng/mL ）：用乙醇溶液（4.5 ）将 5.0 mL维生素 B12贮备液（4.9.1 ）定 容至 500 mL。 4.9.3 维生素 B12工作液（1 ng/mL ）：用乙醇溶液（4.5 ）将 5.0 mL维生素 B12中间液（4.9.2 ）定容 至500 mL。 4.9.4 标准曲线工作液：分别吸取两个 5 mL维生素 B12工作液（ 4.9.3）于 250mL和500mL容量瓶中， 用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为 0.02 ng/mL ；低浓度溶液的浓度为 0.01 ng/mL 。 注：所有标准溶液要储存于冰箱内。4.9.1 、4.9.2和4.9.3保存期三个月，4.9.4 临用前配制。 5 仪器和设备 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 5.1 天平：感量为 0.1 mg。 5.2 pH计：精度≤0.01。 5.3 分光光度计。 5.4 涡旋混合器。 5.5 离心机：转速≥2000 转/分钟。 5.6 恒温培养箱：36 ℃ ± 1 ℃。 5.7 冰箱：2 ℃～ 5 ℃。 5.8 无菌吸管：10 mL （具 0.1 mL刻度）或微量移液器和吸头。 5.9 瓶口分液器：0 mL ～10 mL。 5.10 锥形瓶：200 mL 。 5.11 容量瓶（A 类）：100 mL ，250 mL ，500 mL。 5.12 单刻度移液管（A 类）：容量 5 mL。 5.13 漏斗：直径 90 mm。 5.14 定量滤纸：直径 90 mm。 5.15 试管：18 mm ×180 mm 。 注：准备玻璃仪器时， 使用活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗， 清洗之后要求在 200 ℃干热 2 h。 6 分析步骤 6.1 测试菌液的制备 6.1.1 将莱士曼氏乳酸杆菌 （ATCC 7830 ） 的冻干菌株 （4.1 ） 活化后， 接种到乳酸杆菌琼脂培养基 （4.3.1） 上，36 ℃ ±1 ℃培养 24 h。再转种 2代～3代来增强活力。置 2 ℃～5 ℃冰箱保存备用。每 15 d转种一 次。 6.1.2 将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基（4.3.2 ）中，36 ℃ ± 1 ℃培养 18 h～ 24 h，以 2000 转/分钟离心 2 min～3 min，弃去上清液，加入 10 mL生理盐水（4.4），混匀，再离心 2 min～3 min， 弃去上清液，再加入 10 mL生理盐水（4.4），混匀。如前离心操作，弃去上清液。再加 10 mL生理盐 水（4.4），混匀。吸适量该菌悬液于 10 mL生理盐水（4.4 ）中，混匀制成测试菌液。 6.1.3 用分光光度计（5.3），以生理盐水（4.4）做空白，于 550 nm波长下测测试菌液（6.1.2）的透 光率，使其透光率在 60 %～80 %之间。 6.2 试样的处理