ICS 11.220 B 41 T/CVMA 39-2020 猫冠状病毒实时荧光 RT-PCR检测方法 Real-time RT-PCR method for detection of feline coronavirus 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 团体标准 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 39 -2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不 承担识别专利的责任 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：上海市动物疫病预防控制中心 。 本文件主要起草人：杨德全、 鞠厚斌、 赵洪进、王建、 沈悦、杨显超、沈海潇、李鑫、葛菲菲、陶 田谷晟、于讳茹 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 39 -2020 1 猫冠状病毒实时荧光 RT-PCR检测方法 1 范围 本文件规定了猫冠状病毒实时荧光 RT-PCR检测的操作方法 。 本文件适用于实验室对临床 疑似猫冠状病毒感染 的腹水、肛拭子、粪便、 血液、血清中猫冠状病毒 核酸的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引 用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有 的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 -2016 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 荧光 RT-PCR： 实时荧光反转录聚合酶链式反应（ real-time reverse transcript polymerase chain reaction） BHQ 1： 无荧光淬灭基团（ black hole quencher -1） Ct值： 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环数（ cycle threshold ） DEPC： 焦碳酸二乙酯（ diethy l pyrocarbonate ） FAM： 6-羧基荧光素 （6-carboxyfluorescein ） PBS： 磷酸盐缓冲液（ phosphate -buffered saline buffer ） RNA： 核糖核酸 （ribonucleic acid ） 5 试剂和材料 5.1 引物和探针 上游引物： 5＇-GATT TGA TTTGGCAATG CTAGATTT -3＇ 下游引物： 5＇-AACAATCACTAGATCCAGACGTTAGCT -3＇ TaqMan 探针： 5＇-FAM -TCCATTGTTGGCTCGTCATAGC GGA -BHQ1 -3＇ 5.2 试剂 5.2.1 总则：除非另有说明，所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 的要求，所有试剂均 用 无RNA酶的容器分装。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 39 -2020 2 5.2.2 TRIzol：2 ℃~8 ℃保存。 5.2.3 氯仿： 2 ℃~8 ℃保存。 5.2.4 异丙醇： -20 ℃预冷。 5.2.5 DEPC水：配制方法按 附录 A中A.1。 5.2.6 75% 乙醇：用新开启的无水 乙醇和 DEPC水配制， -20 ℃预冷。 5.2.7 0.01 mol/L PBS 溶液（pH 7.2~ pH 7.4 ）：配制方法按 附录 A中A.2。 5.2.8 阳性对照为灭活的猫冠状病毒；阴性对照为已知猫冠状病毒阴性的猫鼻拭子悬液。 6 仪器设备 6.1 荧光 PCR检测仪。 6.2 高速冷冻离心机。 6.3 振荡器。 6.4 微量移液器（量程： 0.5 µ L~10 µ L 、2 µ L~20 µ L 、20 µ L~200 µ L 和200 µ L~1 000 µ L ）。 6.5 冰箱（ 2 ℃~8 ℃和-20 ℃以下） 7 样品的采集与前处理 7.1 总则 样品的采集、保存与运输 按照 NY/T 541 -2016执行。生物安全要求按照 GB 19489 的规定。 7.2 样品的采集 血液、粪便、肛拭子和腹水样品采集分别按照 NY/T 541 -2016中6.1.2.7、6.8.1、6.8.2和6.16中的 规定执行。 7.3 样品处理 7.3.1 全血、血清样品：分别按照 NY/T 541 -2016中6.1.3.1和6.1.3.3中的规定执行。 7.3.2 粪便样品： 3000 r/min离心 5 min，取上清 液，转入 1.5 mL灭菌离心管中 ，用于后续的核酸提 取。 7.3.3 肛拭子样品：将 肛拭子样品在振荡器上充分混合 后，将拭子中的液体挤出 后弃去拭子。 3000 r/min 离心 5 min，取上清 液，转入 1.5 mL灭菌离心管中 ，用于后续的核酸提取 。 7.3.4 腹水样品： 3000 r/min离心 5 min，取上清 液，转入 1.5 mL灭菌离心管中 ，用于后续的核酸提 取。 8 操作方法 8.1 样品核酸 提取 8.1.1 在样本制备区进行。 RNA抽提使用 TRIzol裂解法提取，也可采用其他等效的 RNA提取方法。 8.1.2 待检样品、阳性对照和阴性对照的份数总和用 n表示，取 n个灭菌 1.5 mL离心管，逐管编号。 8.1.3 每管加入 600 µL TRIzol。 8.1.4 每管对应编号分别加入 200 µL待检样品、阳性对照和阴性对照，混匀。 8.1.5 每管加入 200 µL氯仿，充分颠 倒混匀。于 4 ℃、12000 r/min 离心 15 min。 8.1.6 新取 n个灭菌的 1.5 mL离心管，逐管编号，每管加入 500 µL异丙醇 (-20 ℃预冷 )。 8.1.7 吸取本文件 8.1.5各管中的上清液 500 µL，转移至 8.1.6相应的管中，避免吸出中间层，颠倒混 匀。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 39 -2020 3 8.1.8 于4 ℃、12000 r/min 离心 15 min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应在 吸水纸不同地方沥干。 8.1.9 每管加入 600 µL 75% 乙醇 (-20 ℃预冷 )，颠倒洗涤。 8.1.10 于4 ℃、12000 r/min 离心 10 min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沥干液体，不同样品应 在吸水纸不同地方沥干。 8.1.11 4000 r/min 离心 10 s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量移液器将其吸干。注意一份样 本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一 面。 8.1.12 室温干燥 3 min。 8.1.13 每管加入 11 µL DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2000 r/min 离心 5 s，获得 RNA溶 液，可直接用于检测或保存于 -20 ℃备用。 8.2 扩增试剂的准备与配制 8.2.1 在试剂储存和准备 区进行。 8.2.2 荧光 RT-PCR反应体系 每个检测反应体系需要 22 µL荧光 RT-PCR反应液， 具体 为2× One Step RT -PCR Buffer 10 µL、dNTP （2.5 mmol/L ）1 µL、MgCl 2（25 mmol/L ）1 µL、RNA酶抑制剂（ 40 U/μL）0.5 µL、Taq DNA 聚合酶 （5 U/μL）0.5 µL、M-MLV 反转录酶（ 200 U/μL）0.5 µL、上下游引物 （10 μmol/L）各 1.8 µL、探针 （10 μmol/L）0.6 µL、DEPC水4.3 µL。根据 8.1.2中提到的 n值，按 n+1配制反应液，充分混匀后分 装，每个反应管 22 µL。转移反应管至 样本制备区。 8.3 加样 8.3.1 在样本制备区进行。 8.3.2 在上述 8.2.2的反应管中分别加入 8.1.13中制备的 RNA溶液 3 µL，使每管总体积达到 25 µL， 记录反应管对应的样品编号。盖紧管盖后 ，500 r/min 离心 30 s。转移至 扩增区。 8.4 荧光RT-PCR反应 8.4.1 在扩增区进行。 8.4.2 将8.3.2中加样后的反应管放入荧光 PCR检测仪中，编辑样品表后，选定 FAM作为报告基团 ， 淬灭基团 选none，反应参数设置如下： 42 ℃ 10 min，94 ℃ 15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，在每个循 环第二步（ 60 ℃ 45 s）收集荧光信号，共 40个循环。 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 阈值设定原则：阈值线设定于刚好超过阴性对照扩增曲线的最高点。不同仪器可根据仪器噪音情况 进行调整。 9.2 实验成立的条件 9.2.1 阴性对照无 Ct值并且无 典型的 S型扩增曲线。