ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 17 -2020 新城疫病毒 V蛋白抗体间接 ELISA检测方法 Indirect ELISA detection method of newcastle disease virus V protein antibody 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 17 -2020 目 次 前言................................ ................................ ......... I 1 范围................................ ................................ ....... 1 2 规范性引用文件 ................................ ............................. 1 3 术语定义和缩略语 ................................ ........................... 1 4 原理................................ ................................ ....... 2 5 试验条件 ................................ ................................ ... 2 6 试剂................................ ................................ ....... 2 7 仪器和设备 ................................ ................................ . 3 8 样品采集、运输与保存 ................................ ....................... 3 9 ELISA试验步骤 ................................ ............................. 3 10 试验数据处理 ................................ .............................. 4 11 质量保证和控制 ................................ ............................ 5 12 试验报告 ................................ ................................ .. 5 附录A（规范性） ................................ ............................. 7 附录B（资料性） ................................ ............................. 9 附录C（资料性） ................................ ............................ 10 附录D（规范性） ................................ ............................ 12 附录E（规范性） ................................ ............................ 13 附录F（资料性） ................................ ............................ 15 附录G（资料性） ................................ ............................ 16 附录H（资料性） ................................ ............................ 18 参考文献 ................................ ................................ ... 19 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 17 -2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规 则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：华南农业大学。 本文件主要起草人：任涛、徐成刚、廖明、于得水、梁健鹏、谢鹏、向斌、林秋燕。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 17 -2020 1 新城疫病毒 V蛋白抗体间接 ELISA检测方法 1 范围 本文件规定了 鸡血清中 新城疫病毒 V蛋白抗体间接 ELISA检测方法 。 本文件适用 于鸡群体新城疫病毒 V蛋白抗体检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文本中的规范性引用而构成本文本必不可少的条款。其中，注日 期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包 括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18936 高致病性禽流感诊断技术 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27418 测量不确定度评定和表示 GB/T 33087 仪器分析用高纯水规格及试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 SN/T 2984 检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则 YY/T 1183 酶联免疫吸附法检测试剂 (盒) 3 术语定义和缩略语 下列术语定义 和缩略语适用于本文件。 3.1 新城疫病毒 newcastle disease virus；NDV 副黏病毒科，副黏病毒亚科，禽腮腺炎病毒属，单股负链 RNA病毒。 3.2 酶联免疫吸附试验 enzyme linked immunosorbent assay ；ELISA 指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上， 利用抗原抗体特异性结合进行 免疫反应的定性和定量检测方法。 3.3 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 17 -2020 2 V蛋白羧基端 carboxyl terminus of protein V ；Vc NDV V蛋白是由 P基因通过 “RNA编辑”的方式插入一个鸟嘌呤编码产生， Vc是指 V蛋白的第 101位~240位氨基酸。 3.4 光密度 optical density ；OD 样品吸收掉的光密度。 3.5 辣根过氧化物酶 horseradish peroxidase ；HRP 由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白 。 3.6 四甲基联苯胺 tetramethylbenzidine ；TMB 与HRP活性中心反应产生深蓝色沉淀物，起显色剂作用。 4 原理 间接 ELISA的原理：吸附于固相载体表面的抗原与被检样品中相应的抗体结合形成抗 原抗体复合物， 再加入酶标记的抗体 （抗抗体） ， 加入底物后， 底物被酶催化成为有色产物， 产物颜色的深浅与样品中相应抗体的量呈正比，可根据 颜色的深浅进行定性或定量检测。 NDV复制过程中， P基因经 RNA编辑作用产生非结构蛋白 V。P蛋白与 V蛋白氨基端 区域相同，而羧基端区域不同。为保证单一的抗原抗体反应，本方法利用大肠杆菌原核表达 系统表达 NDV V蛋白第 101位~240位氨基酸的重组蛋白 Vc， 以其作为抗原建立 NDV V蛋 白抗体间接 ELISA检测方法。 5 试验条件 实验室环境的温度和相对湿度分别为： 21 ℃~25 ℃，25 %~75 %。 6 试剂 6.1 NDV Vc 蛋白：按照附录 A的方法制备 ，质检结果见附录 B和附录 C。 6.2 阳性血清： 按照附录 D.1的方法制备 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 17 -2020 3 6.3 阴性血清： 按照附录 D.2的方法制备 。 6.4 酶结合物：商品化的 HRP标记的抗鸡 IgG抗体，工作浓度参照产品说明书。 6.5 抗原包被液： 按照附录 E.1的方法配制。 6.6 磷酸盐缓冲液： 按照附录 E.2的方法配制。 6.7 洗涤液： 按照附录 E.3的方法配制。 6.8 稀释液： 按照附录 E.4的方法配制。 6.9 封闭液： 按照附录 E.5的方法配制。 6.10 TMB显色液：按照附录 E.6的方法配制