广东省农药协会 发布抗菌肽活性检测技术规程 TechnicalStandardforassayofantimicrobialpeptideactivityT/GDPICS65.020 M733 广东省农药协会团体标准 T/GDP021-2020 2020-12-28发布 2020-12-28实施 全国团体标准信息平台 T/GDP021-2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2020的规定编制。 本标准由华南农业大学提出。 本标准由广东省农药协会归口。 本标准起草单位：华南农业大学、广州禾立田生物科技有限公司、韶关禾立田农场有限公司、从化 海关综合服务技术中心、韶关市曲江区田园农业科技发展有限公司、广州市会兴农业科技有限公司。 本标准的主要起草人为：金丰良，许小霞，孔锦容，张展滔，李树忠，王泽清、邵振芳、颜素娟。 本标准为首次发布。 全国团体标准信息平台 T/GDP021-2020 1抗菌肽活性检测技术规程 1范围 本标准规定了昆虫抗菌肽的活力检测技术要求，包括抗菌肽的琼脂孔穴法、最小抑制浓度、最大杀 菌浓度、溶血性等。本标准以家蝇作为材料，对其抗菌肽的活力进行测定，以家蝇抗菌肽Cecropin（Mdcec） 为代表测定。 本标准适用于以家蝇为材料，对其体内的抗菌肽Cecropin（Mdcec）进行抗菌活性测定及抗菌谱判 断，对于其他昆虫等作为材料纯化抗菌肽可参照执行。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅所注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改版本）适用于本文件。 GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 GB/T6682《分析实验室用水规格和试验方法》 GB4789.2食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定。 3术语 下列术语和定义适用于本文件。 3.1抗菌肽（antimicrobialpeptides） 抗菌肽属于一种非特异性的免疫分子，具备广谱抗菌活性，其不仅对细菌、真菌、病毒、支原体以 及部分肿瘤细胞有杀伤作用，还具有免疫调节、信号传导以及抗感染等多种功能。 3.2家蝇（Muscadomestica） 在25℃，相对湿度60%～70%的实验室内饲养家蝇，成蝇喂以白糖和奶粉，每日更换饮水。幼虫 以人工饲料（发酵麦麸）喂养。 3.3多肽（polypeptides） 介于氨基酸与蛋白质之间，有2个或2个以上氨基酸通过肽键连接形成的一类化合物。 全国团体标准信息平台 T/GDP021-2020 23.4多肽活力（antimicrobialactivity） 抑制微生物的能力，以抑菌圈直径来表示。 3.5热处理（HeatTreatment） 抗菌肽是一种弱碱性物质，具有热稳定性、耐低温的特性。将家蝇血淋巴于沸水浴中搅拌加热3min 后，迅速在冰浴中冷却，10,000r.p.m/min离心20min，除去变性蛋白，沉淀再用等体积蒸馏水洗2次， 以同样转速离心20min，合并3次上清液。 3.6超滤膜（ultrafiltrationmembrane） 膜超滤方法经常在分离纯化的初期被用来进行蛋白质样品的富集和粗级的分离。该方法的关键是选 择不同类型和规格的膜。 4试剂或材料 除非另有说明，本方法所用的试剂均为分析纯，实验用GB/T6682规定的水。 4.1生理盐水 0.85%生理盐水：称取8.5g氯化钠，用一级水溶解并定容至1000mL121℃高压灭菌20min。 4.2培养基 LB（Lucia-Bertani）液体培养基：2g胰蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl，ddH2O定容至200mL，混 匀，于高压灭菌锅120℃灭菌20min。 LB固体培养基：2g胰蛋白胨，1g酵母粉，2gNaCl，2g琼脂粉，ddH2O定容至200mL，混匀， 于高压灭菌锅120℃灭菌20min。 PDA（PotatoDextroseAgar）培养基：200g去皮土豆，于ddH2O中煮沸30min，纱布（8层）过 滤固体残渣，后加入20g葡萄糖，20g琼脂粉，继续煮沸至完全溶解，ddH2O定容至1000mL，pH=7.0， 于高压灭菌锅120℃灭菌20min。 4.3菌株 革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（S.aureus），巨大芽孢杆菌（Bacillusmegatherium），蜡状芽孢 杆菌（B.cereus），枯草芽孢杆菌（B.subtilis），短小芽孢杆菌（B.pumilus），藤黄八叠球菌（Sarcina lutea），乳酸菌（Lactobacillusplantarum），保加利亚乳杆菌（L.bulgaricus）。 革兰氏阴性菌：大肠杆菌（E.coliK12D31），荧光假单孢菌（Pseudomonasfluorescent），铜绿假 单孢菌（P.aeruginosa），猪霍乱沙门氏菌（Salmonellacholeraesuis），嗜水气单孢菌（Aeromonas 全国团体标准信息平台 T/GDP021-2020 3hydrophila），温和气单孢菌（A.sobria），爱德华氏菌（Edwardsiellatarda），梅氏弧菌（Vibrio metschnikovi）。 真菌：灰霉菌（Botrytiscinerea），青霉菌（Penicilliumcrustosum），尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）， 黑腐菌（Valsamali）。 5仪器设备 恒温培养箱：温度精度1℃ 电子天平：感温为0.0001g和0.01g 酶标仪（Bio-rad公司)：波长范围190nm~900nm 抑菌圈测量仪：精度0.02mm~0.1mm 血球计数板：16格×25格或25格×16格 玻璃器皿：直径为90mm，底部平整 6实验步骤 6.1家蝇饲养 在25℃，相对湿度60%～70%的实验室内饲养家蝇，成蝇喂以白糖和奶粉，每日更换饮水。幼虫 以人工饲料（发酵麦麸）喂养。 6.2抗菌肽的纯化 取发育历期一致的家蝇3龄幼虫，经0.85%生理盐水洗涤，75%酒精消毒后，用微量注射器注射对 数生长期的E.coliK12D31（浓度约为108个/mL）2μL/每头，在高温消毒的培养皿中饲养24h。每次 约20g三龄幼虫，放入到预冷的研钵中，加入0.05M乙酸铵缓冲液5mL，并加入少许(0.1g)苯基硫脲， 把虫体剪碎、匀浆，用双层纱布过滤，取滤液在10,000r.p.m/min离心20min，上清液通过纱布除去少 量脂肪。再用5mL缓冲液冲洗残渣，混匀，再用10,000r.p.m/min离心20min，取上清。然后合并2次 上清，将上述方法所得血淋巴于沸水浴中搅拌加热10min后，迅速在冰浴中冷却，12,000r.p.m/min离 心20min，除去变性蛋白，沉淀再用等体积蒸馏水洗2次，以同样转速离心20min，合并3次上清液。 上清分别用截留10kDa的超滤离心柱10,000g超滤离心10min，收集滤过部分，然后用截留3kDa的超 滤离心柱10,000g超滤离心10min，弃滤过部分，收集未滤过部分。经超滤收集到的液体用0.1M的乙 酸钠透析过夜，直接上样预先经乙酸钠（pH5.0，0.1M）平衡的CM-SepharoseCL-6B柱，然后以150mL 全国团体标准信息平台 T/GDP021-2020 4平衡液对150mL，pH5.01M的乙酸钠缓冲液作梯度展开，梯度结束后，再用300mL，1MNaAc（pH 5.0）洗脱，流速为0.2mL/min，每1min收集一管，Tricine-SDS-PAGE检测不同收集管的蛋白，将检测 到的蛋白样品合并并冷冻干燥，-80℃保存（参考附录A）。 6.3蛋白浓度的测定 Bradford法检测样品的蛋白浓度，取10mg牛血清白蛋白，用ddH2O溶解并定容到100mL，其终 浓度为100μg/mL。称取100mg考马斯亮蓝G-250溶解至50mL95%的乙醇中，加85%的磷酸100mL， 用ddH2O定容至1000mL。按照附录B配制标准曲线溶液(参考附录B)。 6.4最小抑制浓度 6.4.1细菌菌液活化 分别挑取平板上的细菌单菌落接种于2mLLB培养液中，37℃过夜培养。取此培养液按1/100体积 接种于新鲜的LB培养液中，37℃200rpm剧烈振荡培养至OD600=0.3。 分别挑取在斜面上的真菌孢子放在PDA固体培养基里，25℃培养，相对湿度80%黑暗培养3天左 右；待产孢后，用接种环轻刮平板上的孢子，将孢子转入200ml含100mLPDA培养基的三角瓶中，25℃， 120rpm振荡培养15h备用。 6.4.2指示菌液制备 按照GB4789.2进行指示菌的菌落计数。建立菌落计数与OD600的关系，调整至菌落数为 1*108CFU/mL。 6.4.3样品的检测 将家蝇抗菌肽Mdcec用0.01%的乙酸和0.2%小牛血清白蛋白（bovineserumalbumin,BSA）1/2 倍梯度稀释。取对数生长期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌100μL，再加入不同浓度10μL的抗菌肽，使 每管抗菌肽的终浓度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56μg/mL，混匀，在96孔平板上37℃ 过夜孵育24h，用酶标仪在600nm处测定各管的吸光度。吸光度没有明显变化的抗菌肽的最低浓度为 MIC（MinimalInhibitoryConcentration）(参考附录C)。 6.4.4样品的广谱性测定 将家蝇抗菌肽Mdcec用0.01%的乙酸和0.2%小牛血清白蛋白（bovineserumalbumi